[發(fā)明專利]流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710324078.2
• 申請(qǐng)日: 2017-05-09
• 公開（公告）號(hào): CN106950163B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭西;張澤鈞;袁施彬;吳邦元
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西華師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明公開了一種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法，包括以下步驟：雞處死后，獲取胸腺組織并制取單細(xì)胞懸液；取所述單細(xì)胞懸液，加入抗雞的CD3、CD4和CD8單克隆抗體各一頭份，旋渦混勻，于4℃避光染色；取染色后的細(xì)胞液，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；分析檢測(cè)結(jié)果，獲得雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群比例。本發(fā)明流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法，針對(duì)樣本處理、檢測(cè)及分析過程中目標(biāo)細(xì)胞選取、補(bǔ)償調(diào)節(jié)及參數(shù)選擇的問題，建立了一種穩(wěn)定規(guī)范的雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法。

背景技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)是一種利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)。其工作原理是通過熒光標(biāo)記的單克隆抗體或熒光微球，對(duì)單個(gè)細(xì)胞或分子進(jìn)行標(biāo)記或捕獲后，進(jìn)行多參數(shù)的定量分析。在檢測(cè)過程中，通過非熒光散射信號(hào)，即前向散射光FSC和側(cè)向散射光SSC信號(hào)，可分別獲得與細(xì)胞大小和胞內(nèi)物質(zhì)密度相關(guān)的信息，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群，這一細(xì)胞分群處理過程可以為下一步分析特定靶細(xì)胞群的特點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

流式細(xì)胞分析最大的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)混合細(xì)胞群中各亞群細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。在人類醫(yī)學(xué)中，人外周血T淋巴細(xì)胞亞群(包括CD3、CD4和CD8細(xì)胞)檢測(cè)結(jié)果與患者細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)。例如，可通過CD3⁺CD4⁺CD8^-T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)比例來診斷艾滋病。胸腺是T淋巴細(xì)胞增殖分化的場(chǎng)所，因此檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞各亞群的構(gòu)成情況，可用于科學(xué)研究中評(píng)估雞T淋巴細(xì)胞在胸腺的分化成熟速度和程度。研究發(fā)現(xiàn)，樣本前處理、目標(biāo)細(xì)胞選取、電壓調(diào)節(jié)、熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)、分析時(shí)陽性范圍及參數(shù)選擇等均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，而目前尚無使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的可靠參考方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)樣本處理、檢測(cè)及分析過程中目標(biāo)細(xì)胞選取、補(bǔ)償調(diào)節(jié)及參數(shù)選擇的問題，提供了一種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法，旨在建立一種穩(wěn)定規(guī)范的雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法，

包括以下步驟：

步驟1，獲取受試雞胸腺組織并制取單細(xì)胞懸液；

步驟2，吸取所述單細(xì)胞懸液于兩支流式管中，一份細(xì)胞液中加入抗雞的CD3、CD4和CD8單克隆抗體各一頭份，旋渦混勻，于4℃避光染色，用作檢測(cè)管；另一份用作陰性設(shè)置管；

步驟3，取染色后的細(xì)胞液，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；

步驟4，分析檢測(cè)結(jié)果，獲得雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群比例。

進(jìn)一步地，所述制取單細(xì)胞懸液具體為：將獲取的胸腺組織用機(jī)械破碎法獲得單細(xì)胞，過濾、洗滌后，用預(yù)冷的PBS液稀釋細(xì)胞，獲得濃度為1×10⁶-1×10⁷個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步地，陰性設(shè)置管的處理方式有兩種，一是用同型對(duì)照試劑染色；二是不染色。

進(jìn)一步地，同型對(duì)照試劑的選擇方法具體為：選擇與抗體對(duì)應(yīng)表面標(biāo)志的一抗完全相同種屬來源、相同亞型及熒光標(biāo)記的抗體。例如，檢測(cè)管使用的是小鼠抗雞的CD4FITC標(biāo)記的抗體，說明書上顯示其成份是Mouse IgG1，那么同型對(duì)照就是FITC標(biāo)記的MouseIgG1。熟悉各單抗陽性細(xì)胞的分群情況后，通常使用空白對(duì)照來設(shè)置陰性對(duì)照即可。

進(jìn)一步地，所述染色的時(shí)間為30min。

進(jìn)一步地，所述洗滌具體是以600-1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。