[發明專利]流式細胞術檢測雞胸腺T淋巴細胞亞群的方法

有效

• 申請號: 201710324078.2
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN106950163B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 彭西;張澤鈞;袁施彬;吳邦元
• 申請（專利權）人: 西華師范大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種流式細胞術檢測雞胸腺T淋巴細胞亞群的方法，包括以下步驟：雞處死后，獲取胸腺組織并制取單細胞懸液；取所述單細胞懸液，加入抗雞的CD3、CD4和CD8單克隆抗體各一頭份，旋渦混勻，于4℃避光染色；取染色后的細胞液，用PBS洗滌并重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測；分析檢測結果，獲得雞胸腺T淋巴細胞亞群比例。本發明流式細胞術檢測雞胸腺T淋巴細胞亞群的方法，針對樣本處理、檢測及分析過程中目標細胞選取、補償調節及參數選擇的問題，建立了一種穩定規范的雞胸腺T淋巴細胞亞群的檢測方法。

技術領域

本發明屬于細胞檢測技術領域，具體地說，涉及一種流式細胞術檢測雞胸腺T淋巴細胞亞群的方法。

背景技術

流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)是一種利用流式細胞儀進行單細胞定量分析和分選的技術。其工作原理是通過熒光標記的單克隆抗體或熒光微球，對單個細胞或分子進行標記或捕獲后，進行多參數的定量分析。在檢測過程中，通過非熒光散射信號，即前向散射光FSC和側向散射光SSC信號，可分別獲得與細胞大小和胞內物質密度相關的信息，從而對細胞進行分群，這一細胞分群處理過程可以為下一步分析特定靶細胞群的特點奠定基礎。

流式細胞分析最大的優點是對混合細胞群中各亞群細胞進行分類計數。在人類醫學中，人外周血T淋巴細胞亞群(包括CD3、CD4和CD8細胞)檢測結果與患者細胞免疫功能密切相關。例如，可通過CD3⁺CD4⁺CD8^-T淋巴細胞的絕對數量和相對比例來診斷艾滋病。胸腺是T淋巴細胞增殖分化的場所，因此檢測雞胸腺T淋巴細胞各亞群的構成情況，可用于科學研究中評估雞T淋巴細胞在胸腺的分化成熟速度和程度。研究發現，樣本前處理、目標細胞選取、電壓調節、熒光補償調節、分析時陽性范圍及參數選擇等均會影響檢測結果，而目前尚無使用流式細胞儀檢測雞胸腺T淋巴細胞亞群的可靠參考方法。

發明內容

有鑒于此，本發明針對樣本處理、檢測及分析過程中目標細胞選取、補償調節及參數選擇的問題，提供了一種流式細胞術檢測雞胸腺T淋巴細胞亞群的方法，旨在建立一種穩定規范的雞胸腺T淋巴細胞亞群的檢測方法。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種流式細胞術檢測雞胸腺T淋巴細胞亞群的方法，

包括以下步驟：

步驟1，獲取受試雞胸腺組織并制取單細胞懸液；

步驟2，吸取所述單細胞懸液于兩支流式管中，一份細胞液中加入抗雞的CD3、CD4和CD8單克隆抗體各一頭份，旋渦混勻，于4℃避光染色，用作檢測管；另一份用作陰性設置管；

步驟3，取染色后的細胞液，用PBS洗滌并重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測；

步驟4，分析檢測結果，獲得雞胸腺T淋巴細胞亞群比例。

進一步地，所述制取單細胞懸液具體為：將獲取的胸腺組織用機械破碎法獲得單細胞，過濾、洗滌后，用預冷的PBS液稀釋細胞，獲得濃度為1×10⁶-1×10⁷個/mL單細胞懸液，于4℃保存備用。

進一步地，陰性設置管的處理方式有兩種，一是用同型對照試劑染色；二是不染色。

進一步地，同型對照試劑的選擇方法具體為：選擇與抗體對應表面標志的一抗完全相同種屬來源、相同亞型及熒光標記的抗體。例如，檢測管使用的是小鼠抗雞的CD4FITC標記的抗體，說明書上顯示其成份是Mouse IgG1，那么同型對照就是FITC標記的MouseIgG1。熟悉各單抗陽性細胞的分群情況后，通常使用空白對照來設置陰性對照即可。

進一步地，所述染色的時間為30min。

進一步地，所述洗滌具體是以600-1000r/min的轉速離心5分鐘。