[發(fā)明專利]流式細(xì)胞術(shù)檢測雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710324078.2
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN106950163B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭西;張澤鈞;袁施彬;吳邦元
• 申請（專利權(quán)）人: 西華師范大學(xué)
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.流式細(xì)胞術(shù)檢測雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，獲取受試雞胸腺組織并制取單細(xì)胞懸液，所述制取單細(xì)胞懸液具體為：將獲取的胸腺組織用機(jī)械破碎法獲得單細(xì)胞，過濾、洗滌，所述洗滌具體是以600-1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，后用預(yù)冷的PBS液稀釋細(xì)胞，獲得濃度為1×10⁶-1×10⁷個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟2，取所述單細(xì)胞懸液兩份，一份加入抗雞的CD3、CD4和CD8單克隆抗體各一頭份，旋渦混勻，于4℃避光染色，所述染色的時(shí)間為30min，用于檢測；另一份用于設(shè)置陰性區(qū)；

步驟3，取染色后的細(xì)胞液，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，所述使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，包括：在前向散射光/側(cè)向散射光雙參數(shù)圖中調(diào)節(jié)電壓和電流線性增益參數(shù)，使組織細(xì)胞團(tuán)位于散點(diǎn)圖的中央?yún)^(qū)；選取胸腺細(xì)胞并設(shè)門；用陰性設(shè)置管設(shè)定陰性區(qū)；用檢測管調(diào)節(jié)通道的熒光補(bǔ)償，完成樣品的數(shù)據(jù)獲取；

所述調(diào)節(jié)電壓和電流線性增益參數(shù)，具體為：調(diào)節(jié)側(cè)向散射光通道的電壓，使細(xì)胞位于側(cè)向散射光軸的中段；調(diào)節(jié)前向散射光通道的電流線性增益參數(shù)，使組織細(xì)胞與細(xì)胞碎片分開；

所述調(diào)節(jié)通道的熒光補(bǔ)償，具體為：在CD4和CD8的雙參數(shù)圖中，調(diào)節(jié)CD4⁺CD8⁺細(xì)胞的比例大于60%，且與CD8單陽性細(xì)胞間具有分界；

步驟4，分析檢測結(jié)果，獲得雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群比例；分析檢測結(jié)果，包括：圈取目標(biāo)細(xì)胞并設(shè)門、分別在CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限圖中準(zhǔn)確界定雙陰性區(qū)、單陰性區(qū)和雙陽性區(qū)，分別讀取CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ 、CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺和CD4⁺CD8⁺T淋巴細(xì)胞百分比，從而獲得雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群比例；所述圈取目標(biāo)細(xì)胞并設(shè)門要求圈取除碎片以外98%以上的胸腺組織細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞術(shù)檢測雞胸腺T淋巴細(xì)胞亞群的方法，其特征在于，所述設(shè)定陰性區(qū)具體為：用陰性設(shè)置管上流式細(xì)胞儀，設(shè)定散點(diǎn)圖中十字門左下方的區(qū)域?yàn)殛幮詤^(qū)，調(diào)節(jié)電壓使陰性區(qū)內(nèi)細(xì)胞百分比大于98%。