[發明專利]多交叉恒溫擴增結合金納米生物傳感檢測霍亂弧菌的方法

有效

• 申請號: 201710323212.7
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107167602B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 葉長蕓;王毅;王艷
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明公開了一種多交叉擴增結合金納米生物傳感檢測霍亂弧菌的方法，所述方法在多交叉置換擴增中的交叉引物CP1或CP2的5’端標記生物素，在擴增引物C1或C2的5’端標記半抗原，所述方法針對霍亂弧菌的ompW基因的擴增產物能被金納米生物傳感器可視化檢測。所述方法便捷、快速、敏感、特異，適宜于各種核苷酸片段檢測。

技術領域

本發明公開了一種霍亂弧菌的檢測方法，屬于微生物學領域。

背景技術

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是一種革蘭氏陰性菌，呈絲狀、弧狀或桿狀，有菌毛、單鞭毛，部分有莢膜。該病原體是重要的食源性和水源性疾病的病原體，廣泛存在于河口、海灣及近岸海域的海水環境中。霍亂弧菌常分離自水體(河水、井水及海水)、水產品及臨床標本，引起食源性或水源性的烈性腸道傳染病。霍亂發病急，傳染性強，病死率高，屬于國際檢疫傳染病。霍亂弧菌曾在世界上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐、腹瀉及失水。霍亂弧菌共分為139個血清型，其中O1群和O139群可引起霍亂。非O1非O139群菌株常被認為是環境中的正常菌群。近年來，不斷有非O1非O139群菌株引起的霍亂散發或暴發的報道。因此，為了給予臨床病人快速準確的治療，開展水產品監測以及霍亂弧菌的流行病學調查，研發一個省時、省力、特異性較高，能夠同時檢測和鑒定霍亂弧菌的方法成為必要。

目前對于霍亂弧菌的檢測主要依賴于傳統的增菌培養和生化鑒定，該方法耗時大約3到7天，包括增菌及后續的生化鑒定。傳統的分離鑒定方法耗時耗力，生化結果的判讀依賴于人的主觀判斷，導致結果重復性差，易錯判。隨著核酸檢測技術的快速發展，一些以PCR為基礎的檢測技術(如普通PCR技術，熒光定量PCR技術)被用于霍亂弧菌的快速檢測，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設備，需要后續的電泳操作，昂貴的探針合成，以及熟練的操作人員。對于一些落后的實驗室無法進行，限制了這些技術的運用。目前運用這些技術檢測霍亂弧菌的PCR和 Real-time PCR方法，檢測靈敏度差，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。

為了克服PCR擴增技術的劣勢，近年來發展了許多恒溫擴增技術。恒溫擴增技術相對PCR技術而言，不依賴于熱循環擴增設備，反應速度快，敏感性好。因此，恒溫擴增技術有利于實現快速擴增，便捷檢測及現場檢測。到目前為止，已發展的恒溫擴增技術有10余種，應用較為廣泛的有滾環擴增(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫擴增 (HDA)、環介導恒溫擴增(LAMP)、交叉擴增(CPA)等。然而，這些恒溫技術實現核酸擴增需要多種酶同時工作，依賴于昂貴的試劑，復雜的操作步驟，因此這些方法的實用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速檢測領域及欠發達地區。為了克服PCR技術及現有恒溫擴增技術的劣勢，實現便捷、快速、敏感及特異的擴增核酸序列，發明人近期已經建立了一種新的核酸擴增技術，命名為多交叉置換擴增 (Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)，相關內容公開于 CN104946744A，該專利文件作為現有技術文件構成本申請說明書的一個部分。

MCDA在恒溫條件下實現核酸擴增，僅使用一種恒溫置換酶、擴增速度快、反應靈敏、特異性高。為了使該技術在生物、醫藥及衛生領域應用更廣泛、更經濟。近期，發明人以MCDA為基礎，將MCDA技術與納米生物檢測技術相結合，開發了依賴MCDA技術、實現快速，敏感檢測的納米生物傳感技術，該技術被命名為多交叉恒溫擴增結合金納米生物傳感的核酸檢測技術(Multiple Cross Displacement Amplification label-based goldNanoparticles Lateral Flow Biosensor,MCDA-LFB)，相關內容公開于CN201610872509.4、CN201610942289.8、CN201610982015.1，這些專利文件作為現有技術文件構成本申請說明書的一個部分。