[發(fā)明專利]多交叉恒溫擴增結(jié)合金納米生物傳感檢測霍亂弧菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710323212.7
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107167602B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉長蕓;王毅;王艷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 北京市眾天律師事務(wù)所 11478
• 代理人: 李新軍

1.一種多交叉恒溫擴增結(jié)合金納米生物傳感檢測目的基因的方法，所述方法包括以下步驟：

（1）提取待檢測樣品的基因組；

（2） 提供置換引物F1和F2，所述置換引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置換引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；提供交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQ IDNO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示；同時提供在交叉引物CP1的5’端標(biāo)記有生物素的交叉引物 CP1*；提供擴增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQID NO:6所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示；引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQID NO:12所示；同時提供在所述擴增引物C1的5’端標(biāo)記熒光素的擴增引物C1*；

（3）在鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調(diào)節(jié)劑、引物存在下，使用待檢測樣品的基因組核酸作為模板恒溫擴增DNA；

（4）使用金納米生物傳感器檢測步驟（3）的擴增產(chǎn)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述金納米生物傳感器包括一背板，在所述背板上依次設(shè)置裝有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜及吸水墊，在所述硝酸纖維素膜上依次設(shè)置檢測線及控制線，在金標(biāo)墊、檢測線及控制線區(qū)域依次包被有金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素、抗熒光素抗體及生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增是在61-64℃的環(huán)境中進(jìn)行的。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增是在63℃的環(huán)境中進(jìn)行的。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述目的基因為霍亂弧菌的ompW基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求5的所述的方法，其特征在于，在所述交叉引物CP1的5’端標(biāo)記有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，在所述引物C1的5’端標(biāo)記有熒光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示。

7.一組用于恒溫擴增霍亂弧菌的ompW基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置換引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置換引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的擴增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的擴增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的擴增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的擴增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的擴增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的擴增引物R2，同時提供在交叉引物CP1的5’端標(biāo)記有生物素的交叉引物 CP1*，以及在所述擴增引物C1 的5’端標(biāo)記熒光素的擴增引物C1*。