[發(fā)明專利]基于原生質(zhì)體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法

在審

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• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107099526A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設計）人: 陳孝丑;陳發(fā)興;江瑞榮;巫偉峰;戶帥雅;黃曉慧;陳春;張毅智
• 申請（專利權）人: 福建省林業(yè)科技試驗中心
• 主分類號: C12N15/05
• 分類號: C12N15/05;C12N15/01;C12N13/00
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權代理有限公司11212
• 代理人: 談杰

技術領域

本發(fā)明屬于植物雜交育種技術領域，尤其涉及一種基于原生質(zhì)體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法。

背景技術

紅掌(Anthurium andraenum)為天南星科花燭屬多年生草本植物，原產(chǎn)地為哥倫比亞，是目前世界上暢銷的兼具切花與觀葉盆栽的觀賞植物，具有很高經(jīng)濟價值，市場開發(fā)前景廣闊。目前市場幾乎所有的盆花和切花品種多由花燭屬(Anthurium Schott)種間或紅苞花燭(A.andraeanum Lind)種內(nèi)雜交選育而來，創(chuàng)造了豐富的遺傳變異。荷蘭的安祖、瑞恩等專業(yè)公司和美國的夏威夷大學、佛羅里達大學等研究機構(gòu)經(jīng)過幾十年的培育，推出了眾多花色、花形、株型、抗性等特性各異的切花和盆花品種，但出于商業(yè)利益保護的需要，相關的研究成果一直被視同核心機密而較少公開。我國的紅掌產(chǎn)業(yè)正處在快速發(fā)展進程中，生產(chǎn)中品種主要依賴進口或自繁國外品種的種苗。我國學者紅掌方面的研究，主要集中在組織培養(yǎng)以及栽培技術方面，近年來有些研究者開展了紅掌品種資源的收集、保存、和雜交育種等方面工作。廣州花卉研究中心和華南農(nóng)業(yè)大學共同選育的‘朝霞’和‘彩霞’等盆花品種，以及云南省熱帶作物科學研究所李惠波等人選育出的‘水晶之戀’和‘春曉’等少數(shù)品種目前獲得新品種權和進入商業(yè)化推廣應用階段。但我國總體上缺乏自主知識產(chǎn)權的紅掌新品種，這對于紅掌產(chǎn)業(yè)的良性及快速發(fā)展造成了較大的障礙。因此紅掌種質(zhì)創(chuàng)新和完善雜交育種技術體系，是培育觀賞性好及適應性強的自主品種的重要手段。

綜上所述，現(xiàn)有技術存在的問題是：傳統(tǒng)雜交育種存在紅掌雜交育種周期長，通常耗時7-8年；普遍存在自交或雜交不親和，以及近交后代衰退等生殖障礙；誘變育種中存在紅掌種性突變的有害性和隨機性，輻射育種的目的性不 強的缺陷；紅掌倍性育種亦常常會伴隨紅掌農(nóng)藝性狀和觀賞性狀的降低，一定程度上影響了紅掌多倍體育種的廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于原生質(zhì)體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種基于原生質(zhì)體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，所述基于原生質(zhì)體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，在紅掌幼苗生長中，將幼嫩葉片或根尖經(jīng)消毒后，接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成愈傷組織，然后轉(zhuǎn)入液體誘導培養(yǎng)基進行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細胞系；

將懸浮細胞接種到含有酶解液的液體培養(yǎng)基中進行酶解處理獲得原生質(zhì)體，供體原生質(zhì)體用秋水仙素處理，受體原生質(zhì)體用紫外光照強度下照射處理，然后用利用PEG高ca²⁺-高pH值法誘導進行原生質(zhì)體融合；

融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)培養(yǎng)，將獲得細胞團轉(zhuǎn)接到誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)獲得完整的體細胞雜種植株。

進一步，所述基于原生質(zhì)體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法具體包括以下步驟：

步驟一，原生質(zhì)體制備：在紅掌幼苗生長中，將幼嫩葉片或根尖經(jīng)消毒后，接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成愈傷組織，然后轉(zhuǎn)入液體誘導培養(yǎng)基進行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細胞系；將懸浮細胞接種到含有酶解液的液體培養(yǎng)基中進行酶解處理獲得原生質(zhì)體備用。所述含酶解液液體培養(yǎng)基為：酶解液(3.0％-4.0％纖維素酶+1.0％-1.5％離析酶+1.5％-2.5％果膠酶+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl₂，pH為5.4～5.8)，液體培養(yǎng)基(1/2MS+0.1～0.6mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl₂+50～80g/L葡萄糖+0.1～0.5g/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4～5.8)；

步驟二，供體原生質(zhì)體制備：取步驟一獲得的原生質(zhì)體使用CPW溶液懸浮， 調(diào)整到原生質(zhì)體懸浮液的密度，在紫外光照強度下照射，得到供體原生質(zhì)體；

步驟三，受體原生質(zhì)體制備：取步驟一獲得的原生質(zhì)體使用CPW溶液懸浮，調(diào)整到原生質(zhì)體懸浮液的密度，然后加入秋水仙素處理，在搖床上振蕩，培養(yǎng)得到受體原生質(zhì)體；

步驟四，體細胞雜交：取步驟二供體原生質(zhì)體和步驟三受體原生質(zhì)體,按體積比混合，得親本懸浮液，加入親本懸浮液體積的PEG融合誘導液，再加入親本懸浮液體積的高ca²⁺-高pH溶液，然后使用CPW溶液洗滌，離心得到融合的雜種細胞；