[發明專利]基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法

在審

• 申請號: 201710322832.9
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107099526A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 陳孝丑;陳發興;江瑞榮;巫偉峰;戶帥雅;黃曉慧;陳春;張毅智
• 申請（專利權）人: 福建省林業科技試驗中心
• 主分類號: C12N15/05
• 分類號: C12N15/05;C12N15/01;C12N13/00
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司11212
• 代理人: 談杰

技術領域

本發明屬于植物雜交育種技術領域，尤其涉及一種基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法。

背景技術

紅掌(Anthurium andraenum)為天南星科花燭屬多年生草本植物，原產地為哥倫比亞，是目前世界上暢銷的兼具切花與觀葉盆栽的觀賞植物，具有很高經濟價值，市場開發前景廣闊。目前市場幾乎所有的盆花和切花品種多由花燭屬(Anthurium Schott)種間或紅苞花燭(A.andraeanum Lind)種內雜交選育而來，創造了豐富的遺傳變異。荷蘭的安祖、瑞恩等專業公司和美國的夏威夷大學、佛羅里達大學等研究機構經過幾十年的培育，推出了眾多花色、花形、株型、抗性等特性各異的切花和盆花品種，但出于商業利益保護的需要，相關的研究成果一直被視同核心機密而較少公開。我國的紅掌產業正處在快速發展進程中，生產中品種主要依賴進口或自繁國外品種的種苗。我國學者紅掌方面的研究，主要集中在組織培養以及栽培技術方面，近年來有些研究者開展了紅掌品種資源的收集、保存、和雜交育種等方面工作。廣州花卉研究中心和華南農業大學共同選育的‘朝霞’和‘彩霞’等盆花品種，以及云南省熱帶作物科學研究所李惠波等人選育出的‘水晶之戀’和‘春曉’等少數品種目前獲得新品種權和進入商業化推廣應用階段。但我國總體上缺乏自主知識產權的紅掌新品種，這對于紅掌產業的良性及快速發展造成了較大的障礙。因此紅掌種質創新和完善雜交育種技術體系，是培育觀賞性好及適應性強的自主品種的重要手段。

綜上所述，現有技術存在的問題是：傳統雜交育種存在紅掌雜交育種周期長，通常耗時7-8年；普遍存在自交或雜交不親和，以及近交后代衰退等生殖障礙；誘變育種中存在紅掌種性突變的有害性和隨機性，輻射育種的目的性不 強的缺陷；紅掌倍性育種亦常常會伴隨紅掌農藝性狀和觀賞性狀的降低，一定程度上影響了紅掌多倍體育種的廣泛應用。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法。

本發明是這樣實現的，一種基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，所述基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，在紅掌幼苗生長中，將幼嫩葉片或根尖經消毒后，接種到培養基上培養形成愈傷組織，然后轉入液體誘導培養基進行振蕩懸浮培養得到懸浮細胞系；

將懸浮細胞接種到含有酶解液的液體培養基中進行酶解處理獲得原生質體，供體原生質體用秋水仙素處理，受體原生質體用紫外光照強度下照射處理，然后用利用PEG高ca²⁺-高pH值法誘導進行原生質體融合；

融合產物轉入原生質體液體培養培養，將獲得細胞團轉接到誘導培養基上進行培養獲得完整的體細胞雜種植株。

進一步，所述基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法具體包括以下步驟：

步驟一，原生質體制備：在紅掌幼苗生長中，將幼嫩葉片或根尖經消毒后，接種到培養基上培養形成愈傷組織，然后轉入液體誘導培養基進行振蕩懸浮培養得到懸浮細胞系；將懸浮細胞接種到含有酶解液的液體培養基中進行酶解處理獲得原生質體備用。所述含酶解液液體培養基為：酶解液(3.0％-4.0％纖維素酶+1.0％-1.5％離析酶+1.5％-2.5％果膠酶+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl₂，pH為5.4～5.8)，液體培養基(1/2MS+0.1～0.6mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl₂+50～80g/L葡萄糖+0.1～0.5g/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4～5.8)；

步驟二，供體原生質體制備：取步驟一獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮， 調整到原生質體懸浮液的密度，在紫外光照強度下照射，得到供體原生質體；

步驟三，受體原生質體制備：取步驟一獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮，調整到原生質體懸浮液的密度，然后加入秋水仙素處理，在搖床上振蕩，培養得到受體原生質體；

步驟四，體細胞雜交：取步驟二供體原生質體和步驟三受體原生質體,按體積比混合，得親本懸浮液，加入親本懸浮液體積的PEG融合誘導液，再加入親本懸浮液體積的高ca²⁺-高pH溶液，然后使用CPW溶液洗滌，離心得到融合的雜種細胞；