[發明專利]基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法

在審

• 申請號: 201710322832.9
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107099526A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 陳孝丑;陳發興;江瑞榮;巫偉峰;戶帥雅;黃曉慧;陳春;張毅智
• 申請（專利權）人: 福建省林業科技試驗中心
• 主分類號: C12N15/05
• 分類號: C12N15/05;C12N15/01;C12N13/00
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司11212
• 代理人: 談杰

1.一種基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，其特征在于，所述基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，在紅掌幼苗生長中，將幼嫩葉片或根尖經消毒后，接種到培養基上培養形成愈傷組織，然后轉入液體誘導培養基進行振蕩懸浮培養得到懸浮細胞系；

將懸浮細胞接種到含有酶解液的液體培養基中進行酶解處理獲得原生質體，供體原生質體用秋水仙素處理，受體原生質體用紫外光照強度下照射處理，然后用利用PEG高ca²⁺-高pH值法誘導進行原生質體融合；

融合產物轉入原生質體液體培養培養，將獲得細胞團轉接到誘導培養基上進行培養獲得完整的體細胞雜種植株。

2.如權利要求1所述的基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，其特征在于，所述基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法具體包括以下步驟：

步驟一，原生質體制備：在紅掌幼苗生長中，將幼嫩葉片或根尖經消毒后，接種到培養基上培養形成愈傷組織，然后轉入液體誘導培養基進行振蕩懸浮培養得到懸浮細胞系；將懸浮細胞接種到含有酶解液的液體培養基中進行酶解處理獲得原生質體備用；

步驟二，供體原生質體制備：取步驟一獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮，調整到原生質體懸浮液的密度，在紫外光照強度下照射，得到供體原生質體；

步驟三，受體原生質體制備：取步驟一獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮，調整到原生質體懸浮液的密度，然后加入秋水仙素處理，在搖床上振蕩，培養得到受體原生質體；

步驟四，體細胞雜交：取步驟二供體原生質體和步驟三受體原生質體,按體積比混合，得親本懸浮液，加入親本懸浮液體積的PEG融合誘導液，再加入親本懸浮液體積的高ca²⁺-高pH溶液，然后使用CPW溶液洗滌，離心得到融合的雜種細胞；

步驟五，雜種細胞培養：取步驟四融合細胞轉入原生質體液體培養基進行振蕩培養獲得細胞團，然后轉接到誘導培養基上進行培養獲得完整的體細胞雜種植株。

3.如權利要求2所述的基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，其特征在于，步驟一中，所述在紅掌幼苗生長中，選用生長快、花色好、品質優的紅掌優良單株幼苗。

4.如權利要求2所述的基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，其特征在于，步驟二中，原生質體懸浮液密度為0.5×l0⁵個/mL～l×l0⁵個/mL，在1000μW/cm²～1500μW/cm²紫外光照強度下照射5min～25min。

5.如權利要求2所述的基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，其特征在于，步驟三中，原生質體懸浮液密度為0.5×l0⁵個/mL～l×l0⁵個/mL；加入0.15g/L～0.50g/L秋水仙素處理，在轉速為80r/min～120r/min的搖床上振蕩培養3d～15d。

6.如權利要求2所述的基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法，其特征在于，所述步驟四具體包括：所述取步驟二供體原生質體和步驟三受體原生質體，按按1:1體積比混合，得親本懸浮液，加入1倍～4倍親本懸浮液體積的PEG融合誘導液；在25℃～32℃下保溫15min～30min，再加入2倍～4倍親本懸浮液體積的高ca²⁺-高pH溶液，混合后在25℃～32℃下保溫10min～15min，然后使用CPW溶液洗滌2遍～3遍，離心得到融合的雜種細胞。

7.一種利用權利要求1所述基于原生質體不對稱融合技術的紅掌體細胞雜交育種方法構建的紅掌細胞融合雜交育種體系。