[發明專利]登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201710322563.6
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107226848A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 王明連;陳基湘;劉強強;李勁濤;張婷;鐘儒剛;劉偉
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C07K14/18
• 分類號: C07K14/18;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及基因工程和病毒免疫學診斷領域，具體地說，涉及一種登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段及其制備方法與應用。

背景技術

世界衛生組織(WHO)數據顯示，在過去約七十年間，登革熱(Dengue fever，DF)已成為疫情發展最快的蚊媒傳染疾病，常年危及著生活在熱帶、亞熱帶128個國家和地區約20～50億人的生命安全。DF發病率在過去40年中激增了30多倍，在全球范圍內呈上升態勢，并且正頻繁地往美國、南歐以及澳洲這些非病區擴散。每年有5千萬至1億人感染登革病毒(Dengue virus，DENV)。DENV感染人體后可引起自限性DF以及臨床癥狀較為嚴重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)，而后兩者每年導致約5萬人住院治療，死亡率為2.5％。絕大部分登革熱患者的病情都比較輕。不過約有10％的患者會發展為嚴重的DHF/DSS，此外有少部分患者甚至會因為血管通透性過高出血而死亡。

目前尚且認為登革病毒有四個型別，均可感染人，其中2型重癥率及死亡率均高于其他型別。人群對任何一型DENV的初次感染均較敏感，感染后獲得對同型病毒比較持久的免疫力，一般保持1～4年，而對異型病毒的免疫力則很短暫，只維持2～12個月。因而感染一個型別DENV后還可能發生二次或連續感染即繼發性感染，而繼發性異型感染很可能引起DHF/DSS，從而引發相當高的發病率和病死率。其發生機制在于抗體依賴的感染增強(Antibody dependent enhancement，ADE)效應，即在繼發性異型感染中預先存在的交叉抗體能夠與病毒結合，通過抗體與靶細胞表面的Fc受體的相互作用促進病毒對單核細胞、巨噬細胞以及成熟DC細胞的感染，進而引起血液濃縮、出血或便血甚至休克等臨床癥狀。

2015年12月9日，由法國藥企賽諾菲巴斯德研發的全球第一支嵌合黃熱病登革熱四價疫苗在墨西哥上市。該疫苗使用一種來自黃熱病17D減毒活疫苗病毒的感染性克隆來構建四種嵌合病毒，每一種病毒只表達四種血清型登革病毒之一的包膜蛋白(E蛋白)和前膜蛋白(prM/M蛋白)。這一嚴重威脅全世界數千萬人健康的疾病即將得到遏制，人們似乎看到了曙光。但馬來西亞Sarawak州在2007年暴發了一次登革熱疫情，美國德克薩斯大學醫學中心(University of Texas Medical Branch in Galveston)的病毒學家Nikos Vasilakis經全基因組測序發現這是一株新的登革病毒新發現的登革病毒在人群中流行的可能性將會引起ADE效應，所以人們對該疫苗仍持謹慎態度。

DENV感染個體中抗體類型的研究顯示，初次感染者體內產生針對于該型病毒的結構蛋白及非結構蛋白的抗體類群中，該型特異性中和抗體比例占主要地位，并集中于E蛋白表位。而在繼發性感染中，交叉型抗體占據主要地位，且其針對表達更多集中于prM蛋白區域。與此相似的是，登革病毒特異T細胞反應在繼發性異型感染中也出現廣泛的交叉。由此我們發現，ADE效應多與病毒的結構蛋白E和prM有關，而非結構蛋白可能不會產生ADE效應。

目前尚無抗DENV藥物，感染后的快速診斷和對癥治療尤為重要。預防和控制DENV的傳播主要依靠蚊媒控制，對于DF和DHF還只能對癥治療。根據國家衛生和計劃生育委員會《登革熱診療指南(2014年第2版)》，“根據流行病學史、臨床表現及實驗室檢查結果，可作出登革熱的診斷。在流行病學史不詳的情況下，根據臨床表現、輔助檢查和實驗室檢測結果作出診斷。”目前，實驗室常用的幾種檢測DF的方法有實時熒光PCR檢測DENV核酸，采用免疫層析法檢測DENV特異性NS1抗原和IgM/IgG抗體等。從確診病人在DF不同病程血清中核酸、NS1抗原和IgM/IgG抗體的陽性率各指標變化趨勢可見，現有的任何單一實驗室指標檢測均不足以提供有效、可靠的診斷，需要兩種以上指標共用才具有可靠性，這無疑延遲了診斷時間，增加了檢測成本。由于DF的治療方法對于各型DENV尚無分型，都只是對癥治療，因而實現其快速診斷顯得尤為重要。DENV的快速診斷不僅有助于控制疫情，而且能夠給予患者對癥支持治療，有利于疾病恢復，減少DHF/DSS的發生，降低死亡率。