[發(fā)明專(zhuān)利]登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710322563.6
• 申請(qǐng)日: 2017-05-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107226848A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王明連;陳基湘;劉強(qiáng)強(qiáng);李勁濤;張婷;鐘儒剛;劉偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/18
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/18;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.含有His標(biāo)簽的權(quán)利要求1所述截短片段重組多肽NS5/C70的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)重組質(zhì)粒pQE30-NS5/C70的構(gòu)建：以含有登革2型病毒NS5蛋白編碼基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用BamH I、Hind III雙酶切，純化后回收小片段與線(xiàn)性載體pQE30連接，獲得重組質(zhì)粒pQE30-NS5/C70；

(2)原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒pQE30-NS5/C70轉(zhuǎn)化到E.Coli感受態(tài)M15[pREP4]中，獲得重組菌M15/pQE30-NS5/C70；

(3)重組多肽NS5/C70的表達(dá)及純化；

其中，步驟(1)的引物為：

正向引物F1 5’-GGGGATCCCCAAACCTAGACATAATCGGGAAA-3’

反向引物R1 5’-GCAAGCTTCTACCACAGGACTCCTGCCT-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)具體為：

①增菌培養(yǎng)階段：將重組菌M15/pQE30-NS5/C70接種于含Amp和Kana的2×YT培養(yǎng)基中，添加1％的葡萄糖，于180rpm，37℃通氣條件下培養(yǎng)至OD₅₇₀為0.7-0.8；

②誘導(dǎo)階段：加入IPTG至終濃度為1mM，于25℃，180rpm誘導(dǎo)4h；

③離心收集上清并用0.45μm濾膜過(guò)濾；收集濾液用鎳柱親和層析純化，再經(jīng)不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫，最終得到純化的NS5/C70重組多肽。

4.權(quán)利要求1所述登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段在制備用于不同血清型登革病毒感染的免疫學(xué)診斷試劑中的應(yīng)用。

5.由權(quán)利要求1所述登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段制備的用于不同血清型登革病毒感染的免疫學(xué)診斷試劑。

6.權(quán)利要求1所述登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段在制備用于不同血清型登革病毒感染的膠體金免疫層析診斷試紙條中的應(yīng)用。

7.用于登革病毒感染的膠體金免疫層析診斷試紙條，其特征在于，所述試紙條由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和PVC底板組成，樣品墊、膠體金墊、NC膜和吸水濾紙依次相互疊加粘貼在PVC底板上；

其中，膠體金墊上包被有羊抗人二抗-膠體金復(fù)合物；NC膜上設(shè)有測(cè)試線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述測(cè)試線(xiàn)固定有權(quán)利要求1所述登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段或含有His標(biāo)簽的重組多肽，所述質(zhì)控線(xiàn)固定有SPA。

8.含有權(quán)利要求5所述診斷試劑或權(quán)利要求7所述診斷試紙條的用于各型登革病毒感染的快速檢測(cè)試劑盒。