[發明專利]一種U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201710321897.1
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107012241B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 張新;彭春梅;張曉瑋;鄧可基;樂小炎;張嘉;李家導;陳觀芝;林敏深;林若琳;石壯壯;羅園香;莫靜嫣;李海茵;王星;王法;吳彩虹
• 申請（專利權）人: 東莞微量精準檢測研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 劉曄

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及U6、miR 92a及miR 21三種miRNA進行單管三重逆轉錄的檢測方法及逆轉錄后分別進行單管雙重定量的檢測方法及試劑盒。本發明提供的試劑盒包括逆轉錄莖環引物組、定量檢測引物組和定量檢測探針組、酶系和PCR反應試劑，使得U6、miR 92a及miR 21的逆轉錄可在同一反應管中進行，同時，高靈敏和高特異性的定量檢測引物序列和定量檢測探針及與之相匹配的PCR反應程序和條件，使得miR 21和U6、miR 92a和U6可單管雙重定量，避免了現有技術中單管單重定量時的操作誤差，使定量更簡潔準確。另外，本發明引入Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的雙聚合酶擴增方法，提高檢測特異性的同時，可耐受更多的模版，檢測靈敏度及結果穩定性提高。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，涉及U6、miR92a及miR 21三種miRNA進行單管三重逆轉錄的檢測方法及逆轉錄后進行單管雙重定量的檢測方法及試劑盒。

背景技術

微RNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度為20～24個核苷酸，位于基因組的非編碼區，具有高度保守性，時序性和組織特異性。miRNA在發育、細胞增殖、凋亡、脂類代謝、激素分泌及腫瘤發生等多種生理和病理過程中發揮重要作用。

miR 21是較早發現的人類miRNA之一，在多種生物及哺乳動物多種組織中的廣泛存在。大量研究表明，miR 21可作為原癌基因在多種腫瘤中高表達并參與細胞的增生、分化、凋亡等過程，在腫瘤的發生發展中具有重要作用。因此，檢測miR 21的含量對腫瘤的診斷、治療和預后等具有重要意義。

miR 92a可調控人體細胞中參與細胞分化、凋亡、遷移、免疫等過程中的相關基因表達；另一方面多種腫瘤和疾病，如心血管系統疾病中，存在miR 92a的表達異常情況。因此miR 92a含量可作為一種生物標志物，為相關疾病的診療提供參考，檢測miR 92a含量具有重要基礎和臨床意義。

由于miRNA序列短、沒有poly(A)尾巴、在細胞內的表達水平比較低，且許多同源miRNA(如let-7家族)序列相似度高，僅差1～2個堿基，使設計的分析探針雜交效率低。為了提高雜交反應的親合性和檢測靈敏度，丹麥Exiqon公司的鎖核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)技術被應用于miRNA的分析研究。目前，基于鎖核酸(LNA)等技術的支撐，科學家研究出了多種有效的miRNA檢測方法，如Northern blotting、微陣列法(miRNA array)、克隆和測序法、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法等。

RT-qPCR更加簡單方便，不需標記、操作簡單、成本較低、并且靈敏度極高；能在短時間內獲得結果，可檢測多個miRNA的表達，需要的RNA量較少，因而被廣泛用于組織中miRNA表達譜的構建。

目前miRNA逆轉錄成cDNA的方法主要有三種：引物延伸逆轉錄法；引物加尾法；莖環引物逆轉錄法。延伸及加尾兩種方法操作簡單，一種引物可逆轉錄多種miRNA，但后續的定量依賴經過修飾的定量引物，特異性不高；莖環引物克服了miRNA序列短的缺點，引入莖環序列，進一步增加了RNA-DNA鏈互補配對的堿基數，提高了其熱穩定性，逆轉錄效率增加。但逆轉錄反應后，逆轉錄酶對后續的qPCR有明顯的抑制作用。qPCR采用的信號檢測模式主要有兩種：SYBR Green熒光染料法和TaqMan探針法，后者特異性更好。

目前，莖環引物逆轉錄法中，每種miRNA都需要設計一個特異的反轉錄引物。若需要對樣本中的多個miRNA進行定量，逆轉錄需分管進行，步驟繁瑣，從反轉錄到定量PCR，工作量較大。另外，對miRNA進行定量時，往往需要一個內參基因，單管單重定量時，反應條件不穩定，加樣有誤差，定量不準確，且耗時耗力，較為繁瑣。此外莖環引物及定量引物在同一體系中，引物二聚體嚴重，易引起過度擴增。

發明內容