[發明專利]一種U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201710321897.1
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107012241B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 張新;彭春梅;張曉瑋;鄧可基;樂小炎;張嘉;李家導;陳觀芝;林敏深;林若琳;石壯壯;羅園香;莫靜嫣;李海茵;王星;王法;吳彩虹
• 申請（專利權）人: 東莞微量精準檢測研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 劉曄

1.一種U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的逆轉錄莖環引物組；

所述的逆轉錄莖環引物組包括以下三條特異性逆轉錄莖環引物：

引物stem-loop primer 21，其序列為SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物stem-loopprimer 92a，其序列為SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物stem-loop primer U6，其序列為SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

所述的試劑盒還包括：U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量檢測引物組1和定量檢測引物組2；

所述的定量檢測引物組1包括以下4條定量檢測引物：定量PCR上游引物m2102，其序列為SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；定量PCR下游引物m2103，其序列為SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；定量PCR上游引物U602，其序列為SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；定量PCR下游引物U603，其序列為SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；

所述的定量檢測引物組2包括以下4條定量檢測引物：定量PCR上游引物序列m9202，其序列為SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；定量PCR上游引物序列m9203，其序列為SEQ ID NO：11所示核苷酸序列；定量PCR上游引物U602，其序列為SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；定量PCR下游引物U603，其序列為SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；

所述的試劑盒還包括：酶系、PCR反應試劑；

所述的酶系包括MMLV DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段；

所述的PCR反應試劑包括：pH 8.3～8.5的Tris-H₂SO₄，pH 7.9的3-(N-嗎啉基)丙磺酸，檸檬酸鈉，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄，聚氧乙烯月桂醚，乙酰化牛血清白蛋白和dNTP；

所述的逆轉錄莖環引物組用于對U6、miR 92a及miR 21的單管三重逆轉錄；

所述的試劑盒還包括：U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量檢測探針組；

所述的U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量檢測探針組包括：定量檢測探針組1和定量檢測探針組2；

所述的定量檢測探針組1包括以下2條定量檢測探針：探針m2104：其序列為SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針U604：其序列為SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針m2104和探針U604的核苷酸序列的5’端標記有不同的熒光基團，所述的熒光基團分別選自FAM、HEX、VIC中的一種；探針m2104和探針U604的核苷酸序列的3’端標記有猝滅基團，所述的猝滅基團為MGB；

所述的定量檢測探針組2包括以下2條定量檢測探針：探針m9204：其序列為SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針U604：其序列為SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針m9204和探針U604的核苷酸序列的5’端標記有不同的熒光基團，所述的熒光基團分別選自FAM、HEX、VIC中的一種；探針m2104和探針U604的核苷酸序列的3’端標記有猝滅基團，所述的猝滅基團為MGB；

所述的U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR的定量檢測引物組和定量檢測探針組用于實時熒光RT-qPCR技術，實現對miR 21和U6、miR 92a和U6的單管雙重定量。

2.如權利要求1所述的U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR檢測試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括定量標準品；

所述的定量標準品為：定量標準品1和/或定量標準品2；根據miRNA及莖環引物序列，分別合成miR 21質粒、miR 92a質粒和U6質粒；miR 21質粒含有如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列，miR 92a質粒含有如SEQ ID NO：14所示核苷酸序列，U6質粒含有如SEQ ID NO：15所示核苷酸序列；計算質粒拷貝數，U6、miR 92a和miR 21質粒分別稀釋至E5、E4、E3、E2拷貝數/μl；將同濃度的U6、miR 21質粒混合，即得到同時含U6、miR 21質粒且U6、miR 21質粒濃度分別為5E4、5E3、5E2、5E拷貝數/μl的定量標準品1；將同濃度的U6、miR 92a質粒混合，即得到同時含U6、miR 92a質粒且U6、miR 92a質粒濃度分別為5E4、5E3、5E2、5E拷貝數/μl的定量標準品2。