[發(fā)明專利]一種標(biāo)記存活的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及其細(xì)胞壁的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710321663.7
• 申請(qǐng)日: 2017-05-09
• 公開（公告）號(hào): CN108865918B
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李學(xué)兵;丁超;孫歡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N11/089;C12Q1/04
• 代理公司: 北京信慧永光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11290
• 代理人: 朱學(xué)珺;董世豪

本發(fā)明涉及一種對(duì)存活的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁進(jìn)行標(biāo)記的方法。所述方法通過(guò)生物正交反應(yīng)，利用細(xì)菌自身的代謝途徑將疊氮修飾的全乙酰化N?乙酰葡糖胺?1?磷酸摻入細(xì)胞壁肽聚糖中，隨后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)至肽聚糖，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌肽聚糖的標(biāo)記。所述方法具有普適性，可用于快速、便捷地標(biāo)記革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過(guò)生物正交反應(yīng)，利用細(xì)胞壁的生物合成途徑來(lái)標(biāo)記存活的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的方法。

背景技術(shù)

目前已知多種細(xì)菌的細(xì)胞表面標(biāo)記技術(shù)。例如，可使用表達(dá)能夠與細(xì)菌表面蛋白結(jié)合的目標(biāo)蛋白的基因工程方法。然而，此類細(xì)胞表面工程學(xué)方法僅適用于標(biāo)記蛋白和多肽類。與基因操作方法相比，基于代謝路徑的化學(xué)方法可通過(guò)添加代謝類似物小分子，利用細(xì)胞自身的代謝通路將非天然化學(xué)標(biāo)簽共價(jià)連接至不同的非天然表位。

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的典型組成成份之一為肽聚糖。肽聚糖是一種網(wǎng)絡(luò)狀雜多糖，其骨架由肽和聚糖兩部分組成，其中的肽包括四肽尾和肽間橋兩部分，而聚糖是由N-乙酰葡糖胺(G)和N-乙酰胞壁酸(M)兩種單糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵交替相連成的長(zhǎng)鏈。真核細(xì)胞中不含肽聚糖，因此，肽聚糖是很好的抑制或標(biāo)記細(xì)菌的靶標(biāo)。然而目前，對(duì)肽聚糖在細(xì)菌中的生物合成途徑知之甚少。對(duì)于肽聚糖的研究也僅限于發(fā)現(xiàn)其作為抑制劑靶標(biāo)的潛在新用途。近十年來(lái)，對(duì)肽聚糖的合成進(jìn)行追蹤或編輯的研究取得了很大的進(jìn)展。最近報(bào)道的肽聚糖的成像方法包括利用熒光標(biāo)記的凝聚素(或抗體)、利用能夠作用于細(xì)胞壁的帶有熒光標(biāo)簽的抗生素、基于對(duì)游離的硫醇進(jìn)行檢測(cè)或放射性物質(zhì)示蹤的代謝標(biāo)記的策略、利用熒光底物的酶法等。盡管這些技術(shù)已經(jīng)用于揭示細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖代謝的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，然而，這些技術(shù)操作過(guò)于繁雜而分辨率較低，且僅適用于特定的細(xì)菌種屬，在應(yīng)用的普適性方面存在很大的局限性。在上述技術(shù)中，熒光標(biāo)記的抗體技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)溶解性較高而最為廣泛應(yīng)用。然而，熒光標(biāo)記的抗體可抑制細(xì)菌的活性，難以用其標(biāo)記生長(zhǎng)初期的革蘭氏陽(yáng)性菌。目前仍存在對(duì)于不干擾細(xì)菌生長(zhǎng)的肽聚糖標(biāo)記方法的需求。

生物正交反應(yīng)是指具有如下特征的化學(xué)反應(yīng)：在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，不干擾同時(shí)發(fā)生的其它生化反應(yīng)或各種生物內(nèi)源過(guò)程，且不會(huì)對(duì)生物體及生物內(nèi)源分子造成損傷。目前最常用的生物正交反應(yīng)基團(tuán)對(duì)包括能夠發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)(Click Chemistry)反應(yīng)的疊氮基-炔基以及疊氮基-三芳基膦。其中，疊氮基與三芳基膦發(fā)生的施陶丁格反應(yīng)(StaudingerLigation)或與炔基發(fā)生的環(huán)加成反應(yīng)均能將與該生物正交反應(yīng)基團(tuán)對(duì)中的一個(gè)成員相連的糖偶聯(lián)至與該生物正交反應(yīng)基團(tuán)對(duì)中的另一成員相連的可檢測(cè)標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)將可檢測(cè)標(biāo)記物修飾至糖的目的。其中，疊氮基團(tuán)與高張力炔烴的環(huán)加成反應(yīng)(Strain-promotedazide-alkyne cycloaddition，SPAAC)因其不需要添加催化劑而成為研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。自2001年點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)被提出以來(lái)，該反應(yīng)已被廣泛應(yīng)用于表面修飾、樹枝狀化合物和功能聚合物的生成、細(xì)胞標(biāo)記、生物醫(yī)藥合成、核酸或碳納米管的修飾等。CN104039977B提出了一種利用疊氮基-炔基生物正交反應(yīng)標(biāo)記革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖的方法。然而，目前還未報(bào)道對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁進(jìn)行標(biāo)記的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在利用革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌自身的代謝路徑，將代謝類似物小分子添加至細(xì)胞壁，并基于生物正交反應(yīng)來(lái)開發(fā)對(duì)存活的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及其細(xì)胞壁進(jìn)行標(biāo)記的方法。

一方面，本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)存活的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記的方法，所述方法包括如下步驟：

(i)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌培養(yǎng)基中添加疊氮修飾的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，將革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌接種入所述培養(yǎng)基中并對(duì)所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，得到細(xì)菌培養(yǎng)物；

(ii)收集步驟(i)得到的所述細(xì)菌培養(yǎng)物，通過(guò)處理得到所述細(xì)菌培養(yǎng)物的沉淀物；

(iii)對(duì)步驟(ii)獲得的所述沉淀物中的細(xì)菌進(jìn)行固定；