[發(fā)明專利]一種標記存活的革蘭氏陽性細菌及其細胞壁的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710321663.7
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN108865918B
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發(fā)明（設計）人: 李學兵;丁超;孫歡
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N11/089;C12Q1/04
• 代理公司: 北京信慧永光知識產(chǎn)權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 朱學珺;董世豪

1.一種對存活的革蘭氏陽性細菌進行標記的方法，所述方法包括如下步驟：

(i)在革蘭氏陽性細菌培養(yǎng)基中添加疊氮修飾的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，將革蘭氏陽性細菌接種入所述培養(yǎng)基中并對所述革蘭氏陽性細菌進行培養(yǎng)，得到細菌培養(yǎng)物；

(ii)收集步驟(i)得到的所述細菌培養(yǎng)物，通過處理得到所述細菌培養(yǎng)物的沉淀物；

(iii)對步驟(ii)獲得的所述沉淀物中的細菌進行固定；

(iv)向步驟(iii)的經(jīng)固定的細菌中添加連接有炔基或三芳基膦的可檢測標記物，從而將所述標記物偶聯(lián)至所述細菌內的肽聚糖；

(v)對所述可檢測標記物進行檢測；

其中，所述疊氮修飾的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸為(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-(疊氮基甲基)-6-(膦酰基氧基)-3,4-二乙酰氧基-四氫-2H-吡喃。

2.如權利要求1所述的方法，其中，所述連接有炔基的可檢測標記物選自于由如下物質所組成的組：

其中，所述連接有三芳基膦的可檢測標記物選自于由如下物質所組成的組：

其中，所述是直接或間接連接至炔基部分或三芳基膦部分的可檢測標記物。

3.如權利要求1所述的方法，其中，所述可檢測標記物選自于：放射性同位素、發(fā)色團、抗體、化學發(fā)光化合物、光譜比色標記物、熒光化合物、金屬螯合物和酶。

4.如權利要求3所述的方法，其中，所述放射性同位素選自于：

³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P。

5.如權利要求3所述的方法，其中，所述熒光化合物選自于：

熒光素、羅丹明及其衍生物、青色素染料和香豆素。

6.如權利要求5所述的方法，其中，所述熒光化合物選自于：6-羧基熒光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素、異硫氰酸熒光素、N,N,N’,N’-四甲基-6羧基羅丹明、6-羧基-X-羅丹明、5-羧基羅丹明-6G、6-羧基羅丹明-6G、羅丹明110、四羅丹明異硫氰酸酯、Cy3染料、Cy5染料和Cy7染料、傘形酮。

7.如權利要求6所述的方法，其中，所述熒光化合物為N,N,N’,N’-四甲基-6羧基羅丹明。

8.如權利要求3所述的方法，其中，所述酶選自于螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶。

9.如權利要求3所述的方法，其中，所述酶選自于：

蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類固醇異源性酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。

10.如權利要求3所述的方法，其中，所述化學發(fā)光化合物選自于：

光澤精、魯米諾、(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、異魯米諾、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三聯(lián)吡啶釕和草酸酯。

11.如權利要求3所述的方法，其中，所述光譜比色標記物選自于：

膠體金或者有色玻璃或塑料珠。

12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中，所述可檢測標記物直接連接至所述炔基部分或三芳基膦部分，從而形成所述連接有炔基或三芳基膦的可檢測標記物。

13.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中，所述可檢測標記物經(jīng)由配體-受體結合對或生物素-親和素配偶體對連接至所述炔基部分或三芳基膦部分，從而形成所述連接有炔基或三芳基膦的可檢測標記物。