[發明專利]HBV cccDNA的富集提取方法及檢測引物組、探針和方法

有效

• 申請號: 201710321005.8
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN106916908B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 羅園香;謝麗娟;張曉瑋;彭春梅;鄧可基;樂小炎;張嘉;李家導;陳觀芝;林敏深;林若琳;石壯壯;莫靜嫣;李海茵;張新;王星;王法;吳彩虹
• 申請（專利權）人: 廣州海力特生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/93
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 劉曄

本發明屬于生物技術領域，具體涉及病毒檢測領域，更具體涉及一種HBV cccDNA的富集提取方法和檢測HBV cccDNA的引物組、探針和方法。檢測引物組為引物組1或引物組2。引物組1由以下4條引物序列組成：引物1：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1；引物2：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2；引物3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3；引物4：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4。引物組2由以下4條引物序列組成：引物5：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；引物6：其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物7：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；引物8：其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。和現有技術相比，本發明提供的方法具有更高的準確性、特異性和靈敏性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及病毒檢測領域，更具體涉及一種HBV cccDNA的富集提取方法和檢測HBV cccDNA的引物組、探針和方法。

背景技術

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行，其感染者已超過二十億，是我國目前危害最嚴重的傳染病之一。2006年全國乙肝流行病學調查顯示，我國目前仍有乙肝表面抗原攜帶者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬，乙肝和肝癌患者約占全球的四分之一。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原發性肝癌的主要原因，并且每年導致1百余萬人死亡，造成極大的社會危害。

HBV為嗜肝DNA病毒，是引起乙型病毒性肝炎(以下簡稱“乙肝”)的病原體。細胞外乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環狀的雙鏈DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)分子，其兩條鏈均不是閉合的，其中負鏈較長，約3200個堿基，含有乙肝病毒基因組的全長基因，在其5’起始端與3’末端之間有一個數個堿基的“缺刻”(nick)；正鏈較短，有較大的“缺口”(gap)，其3’末端不固定，故長度是可變的，約為負鏈長度的50％～100％。在乙肝病毒的復制過程中，病毒DNA進入宿主細胞核，在DNA聚合酶的作用下，兩條鏈的缺口均被補齊，形成超螺旋的共價、閉合、環狀DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)，作為乙肝病毒前基因組RNA復制的原始模板，開始一系列的復制過程。雖然其含量較少，每個肝細胞內只有約5～50個拷貝，但對乙肝病毒的復制以及感染狀態的建立具有十分重要的意義。HBV復制是一種保守的機制，在轉錄后模板cccDNA仍然完整，并且可反復轉錄，所以cccDNA是嗜肝病毒持續感染的關鍵因素。cccDNA半衰期長，無法從體內徹底清除，臨床中有很多經過長期抗病毒治療完全應答的患者，停止抗病毒治療后，又常發生HBV再激活和病情復發，主要原因cccDNA的持續存在和難以清除。故cccDNA是HBV復制的突出標志，是評價HBV感染狀態及藥物療效最重要的指標。只有清除了細胞核內的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態，是抗病毒治療的目標。