[發(fā)明專利]提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法

有效

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• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107099548B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設計）人: 劉雁華;王媛媛;賈志偉;宋慶芳
• 申請（專利權）人: 北京大北農(nóng)生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法，所述選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞的方法包括：使用含有目標基因和編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化植物細胞；通過外施ALS抑制劑對上述轉(zhuǎn)化后的植物細胞進行篩選培養(yǎng)，以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇標記物；選擇未被殺死和/或未被抑制的植物細胞。本發(fā)明首次提出在植物轉(zhuǎn)化過程中以外施的方式(特別是滴加)將選擇劑加入增殖培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中，并優(yōu)化了選擇劑有效的篩選濃度范圍，其后代獲得陽性植株的比例和轉(zhuǎn)化效率顯著升高；同時本發(fā)明使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標記物的轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株商業(yè)價值高、抗性好且遺傳穩(wěn)定。

技術領域

本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種通過外施篩選劑以提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法。

背景技術

隨著轉(zhuǎn)基因植物種類和種植面積的迅猛增加，轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因的生物安全性已成為人們普遍關注的問題之一。合適的標記基因可以為獲得真正的轉(zhuǎn)化體提供有力的判斷依據(jù)，在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著至關重要的作用。目前在植物遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應用的標記基因有抗生素抗性基因(如NPTⅡ基因、HPT基因等)和除草劑抗性基因(如PAT基因、EPSPS基因、bar基因等)，由于選擇標記基因一旦轉(zhuǎn)化成功便不再有用，甚至對生態(tài)環(huán)境和食品安全存在潛在威脅，所以對生物安全性標記基因的開發(fā)顯得非常重要。

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，以下稱為“ALS”)存在于植物生長過程中，它能以高度專一性和極高的催化效率催化丙酮酸為乙酰乳酸，從而導致支鏈氨基酸的生物合成。亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸是植物體內(nèi)3種必需的支鏈氨基酸，而ALS不僅是催化亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸生物合成過程中的關鍵酶，其活性也受產(chǎn)物纈氨酸和異亮氨酸的反饋調(diào)節(jié)。

ALS抑制劑是一類已知的除草劑，其通過抑制植物體內(nèi)的ALS活性而阻止植物體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，導致蛋白質(zhì)的合成受到破壞，從而使植物細胞的有絲分裂停止于G1階段的S期(DNA合成期)和G2階段的M期，干擾了DNA的合成，細胞因此不能完成有絲分裂，導致植物組織失綠、黃化，植株生長受抑，最終達到殺死生物個體的目的。因此，ALS抑制劑不僅具有超高活性，而且以其超高效、廣譜、低毒、低殘留、高選擇性和良好的環(huán)境相容性備受歡迎，同時由于抑制ALS抑制劑的靶標不涉及人和動物，故其對人和動物十分安全，亦為標記基因和除草劑耐受性狀提供了新的選擇。

ALS抑制劑包括磺酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑、三唑并嘧啶類除草劑、嘧啶基硫代苯甲酸類除草劑或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類除草劑等。已報道了在植物轉(zhuǎn)化過程中能以磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標記物，但轉(zhuǎn)化效率有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種提高大豆轉(zhuǎn)化效率的方法，有效克服現(xiàn)有技術將ALS抑制劑配置在培養(yǎng)基中存在的假陽性植株率較高、轉(zhuǎn)化效率低等技術缺陷，為規(guī)?；z傳轉(zhuǎn)化及培育具有耐受除草劑性狀的植物提供新的選擇。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞的方法，包括：

使用含有目標基因和編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化植物細胞；

通過外施ALS抑制劑對上述轉(zhuǎn)化后的植物細胞進行篩選培養(yǎng)，以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇標記物；

選擇未被殺死和/或未被抑制的植物細胞。

進一步地，所述轉(zhuǎn)化植物細胞為通過農(nóng)桿菌介導過程轉(zhuǎn)化植物細胞。

更進一步地，所述植物細胞為大豆細胞。

具體地，所述外施包括滴加、噴施或涂抹。

具體地，所述ALS抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。