[發(fā)明專利]一種抗m6A單克隆抗體的制備方法

在審

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• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107236045A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設計）人: 王芳;孫樹漢;朱怡卿;劉巖;馬金召;黃金鳳;袁繼行;楊富;薛賡
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/577;G01N33/53;C07H19/167;C07H1/00
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)學生物工程技術領域，具體地說，是一種抗m6A單克隆抗體的制備方法。

背景技術

人類DNA和蛋白質上存在著豐富的化學修飾，其動態(tài)變化發(fā)揮著重要的作用，通過參與基因表達調控，決定細胞的狀態(tài)，影響細胞的分化和發(fā)育。最新的研究表明，RNA中的化學修飾與DNA和蛋白質中的化學修飾相似，也在調控個體生命活動中發(fā)揮著重要的作用。其中，m6A是真核生物中最常見的RNA轉錄后修飾形式，也是近年來表觀遺傳學研究的熱點。m6A是發(fā)生在堿基A第六位N原子上的甲基化修飾形式，其導致了超過80％的RNA堿基甲基化。越來越多的研究證實，基于m6A修飾的RNA甲基化調控通過調節(jié)mRNA 及miRNA的剪接、轉運、代謝，參與機體發(fā)育、代謝及繁殖的整個過程，并與多種疾病密切相關。目前，人們對RNA甲基化的動態(tài)變化的檢測及在轉錄組中的分布研究主要依賴于基于m6A單克隆抗體的ELISA和MeRIP技術，因此，制備具有高特異性、高親和力的m6A單克隆抗體十分重要。

m6A的分子量小于1000Da，屬于僅有反應原性而無免疫原性的半抗原，難以通過常規(guī)的動物免疫制備抗體。目前，制備小分子半抗原抗體的一般方法是：通過共價鍵使半抗原與大分子質量蛋白質載體偶聯(lián)，制備人工免疫原，經(jīng)動物免疫程序制備特異性抗體。其中，涉及半抗原的設計，連接臂的引入及活性基團的選擇等多個技術環(huán)節(jié)，工藝復雜。

因此，提供一種簡單、易行的適用于m6A的抗體制備方法具有重要的意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種抗RNA表觀遺傳修飾m6A的單克隆抗體的制備方法，用于解決現(xiàn)有技術中通過載體蛋白偶聯(lián)m6A來制備m6A抗體技術工藝復雜成本高的問題。

本發(fā)明的第一方面，提供一種抗m6A單克隆抗體的制備方法，包括：步驟一，活化載體納米磁珠；步驟二，以所述納米磁珠為載體，通過與核苷偶聯(lián)制備免疫原；步驟三，利用所述的免疫原制備m6A抗體；

其中，所述的核苷是m6A，其化學結構如下式所示；

所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團含量在～200μm；磁核為Fe₃O₄。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述的載體納米磁珠選自由蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司生產(chǎn)的NHS磁珠。

所述的步驟一活化載體納米磁珠的步驟包括：磁珠預處理，充分混勻磁珠后，取100μL磁珠到1mL EP管中，磁吸去除上清液，用200μL PBS溶液洗滌 3次，磁吸去上清；戊二醛活化，加入新鮮配制的質量體積比為15％的戊二醛溶液到EP管中，渦旋混勻，避光反應1h；活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用PBS緩沖液洗滌3次。

所述的步驟二納米磁珠與核苷偶聯(lián)制備免疫原的步驟包括：向裝有磁珠的 EP管中加入200μg m6A，輕柔混勻，避光反應3h；將EP管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μL PBS溶液重懸磁珠，反應1h；將EP 管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用PBS洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

所述的步驟三利用所述的免疫原制備m6A抗體的步驟包括：將上述納米磁珠與核苷偶聯(lián)物作為免疫原免疫小鼠；獲取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合；經(jīng)過多輪篩選獲得分泌識別m6A單分子的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；通過在小鼠體內接種上述雜交瘤細胞生產(chǎn)腹水抗體，將腹水進行純化，得到所述的抗m6A單克隆抗體。

本發(fā)明的第二方面，提供一種m6A偶聯(lián)復合物，包括核苷及其偶聯(lián)的載體納米磁珠，其中核苷是m6A，其化學結構如下式所示；所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團含量在～200μm；磁核為Fe₃O₄；

所述的m6A偶聯(lián)復合物的制備方法，包括以下步驟：

a)磁珠預處理，充分混勻磁珠后，取100μL磁珠到1mL EP管中，磁吸去除上清液，用200μL PBS溶液洗滌3次，磁吸去上清；

b)戊二醛活化，加入新鮮配制的戊二醛溶液(15％)到EP管中，渦旋混勻，避光反應1h；

c)活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用PBS緩沖液洗滌3次；

d)向裝有磁珠的EP管中加入200μg m6A，輕柔混勻，避光反應3h；

e)將EP管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μL PBS 溶液重懸磁珠，反應1h；