[發明專利]一種抗m6A單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201710318112.5
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107236045A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 王芳;孫樹漢;朱怡卿;劉巖;馬金召;黃金鳳;袁繼行;楊富;薛賡
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/577;G01N33/53;C07H19/167;C07H1/00
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙)31268
• 代理人: 趙青

1.一種抗m6A單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括：步驟一，活化載體納米磁珠；步驟二，以所述納米磁珠為載體，通過與核苷偶聯制備免疫原；步驟三，利用所述的免疫原制備m6A抗體；其中，所述的核苷是m6A，其化學結構如下式所示；所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團含量在～200μm；磁核為Fe₃O₄；

2.根據權利要求1所述的抗m6A單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的步驟一活化載體納米磁珠的步驟包括：磁珠預處理，充分混勻磁珠后，取100μL磁珠到1mL EP管中，磁吸去除上清液，用200μL PBS溶液洗滌3次，磁吸去上清；戊二醛活化，加入新鮮配制的質量體積比為15％的戊二醛溶液到EP管中，渦旋混勻，避光反應1h；活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用PBS緩沖液洗滌3次。

3.根據權利要求1所述的抗m6A單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的步驟二納米磁珠與核苷偶聯制備免疫原的步驟包括：向裝有磁珠的EP管中加入200μg m6A，輕柔混勻，避光反應3h；將EP管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μL PBS溶液重懸磁珠，反應1h；將EP管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用PBS洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

4.根據權利要求1所述的抗m6A單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的步驟三利用所述的免疫原制備m6A抗體的步驟包括：將納米磁珠與核苷偶聯物作為免疫原免疫小鼠；獲取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合；經過多輪篩選獲得分泌識別m6A單分子的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；通過在小鼠體內接種所述的雜交瘤細胞生產腹水抗體，將腹水進行純化，得到所述的抗m6A單克隆抗體。

5.一種m6A偶聯復合物，其特征在于，包括核苷及其偶聯的載體納米磁珠，其中核苷是m6A，其化學結構如下式所示；所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團含量在～200μm；磁核為Fe₃O₄；

6.根據權利要求5所述的m6A偶聯復合物，其特征在于，所述的m6A偶聯復合物的制備方法，包括以下步驟：

a)磁珠預處理，充分混勻磁珠后，取100μL磁珠到1mL EP管中，磁吸去除上清液，用200μL PBS溶液洗滌3次，磁吸去上清；

b)戊二醛活化，加入新鮮配制的15％的戊二醛溶液到EP管中，渦旋混勻，避光反應1h；

c)活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用PBS緩沖液洗滌3次；

d)向裝有磁珠的EP管中加入200μg m6A，輕柔混勻，避光反應3h；

e)將EP管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μL PBS溶液重懸磁珠，反應1h；

f)將EP管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用PBS洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。