[發明專利]黃瓜雄性不育基因、分子標記、篩選方法及其用途

有效

• 申請號: 201710313270.1
• 申請日: 2017-05-05
• 公開（公告）號: CN107058552B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 韓毅科;杜勝利;趙峰月;魏愛民;劉楠;陳正武;付薪蒙
• 申請（專利權）人: 天津科潤農業科技股份有限公司黃瓜研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/29;C07K14/415
• 代理公司: 北京匯知杰知識產權代理有限公司 11587
• 代理人: 楊巍;蔡倫

本發明涉及與黃瓜雄性不育基因相關的SNP和InDel標記及其篩選方法，并根據這些標記篩選獲得了黃瓜雄性不育基因。具體地，篩選方法包括如下步驟。(1)配置群體；(2)建庫測序；(3)分離群體分組分析(BSA)和(4)競爭性等位基因特異性PCR(KASP)，精細定位不育基因，并得到與不育性狀緊密連鎖的SNP或InDel位點。該雄性不育基因的獲得為快速鑒定黃瓜雄性不育性植株和黃瓜雜交種的高效生產提供了有效的工具。

技術領域

本發明涉及分子遺傳育種技術領域，具體地說，涉及與黃瓜雄性不育基因相關的SNP或InDel的標記，及其篩選，以及獲得的雄性不育基因及它們在鑒定雄性不育植株的用途。

背景技術

目前在其他作物上定位了很多雄性不育基因，并開發了很多與雄性不育基因緊密連鎖的標記，但在在黃瓜上雄性不育基因的報道很少，更談不上應用。此外，目前利用最多的是核質互作不育系、光敏不育系及溫敏不育系等，對核不育基因的利用很少，主要是因為難以找到保持系。傳統上基因定位的方法是利用已有的分子標記，分離群體中大量的篩選差異條帶，定位基因太過耗時耗力。

雖然專利申請CN105420408A對黃瓜不育基因的分子標記進行了探索，但是其只獲得了一個SNP標記，并且該SNP標記過于單一，不能定位黃瓜不育基因。

發明內容

在本申請的一個實施方案中，本申請涉及一種獲得植物雄性不育分子標記SNP或InDel標記和定位雄性不育基因的方法。所述方法包括以下步驟：

（1）配置群體：將植物雄性不育系作為母本與可育遠緣品種為父本進行雜交，得到雜種F1，由雜種F1自交得到F2代分離群體，F2代分離群體中存在雄性可育和雄性不育兩種表型；

（2）建庫測序：提取母本、父本、F2代中可育單株和不育單株的基因組DNA并分別混合形成4個混池即母本池、父本池、可育池及不育池，對各混池的基因組DNA進行雙末端測序，對測序得到的讀段用BWA軟件與正常黃瓜基因組比對，基于比對的結果，使用GATK軟件進行SNP的檢測和注釋；

（3）分離群體分組分析（BSA）：根據測序獲得的SNP的檢測結果，計算可育池與不育池的Δ（SNP-index）值，采用Δ（SNP-index）值的99%的置信區間，來確定目標基因所在區域。其中SNP-index指某個染色體位點含有SNP的讀段數與測到的該位點的總讀段數的比值， Δ（SNP-index) 指可育池與不育池的SNP-index值之差（Takagi 等人，2013）；

（4）競爭性等位基因特異性 PCR (KASP)：針對候選區間內選取的候選SNP 位點設計SNP 分型引物在938株F2群體中進行KASP分型，得到與不育性狀緊密連鎖的SNP或InDel位點；

（5）根據KSAP分型結果構建遺傳圖譜，定位雄性不育基因。

本研究引入了一個SNP位點的測序深度相關的參數SNP-index，該參數是指某個位點含有SNP的讀段數與測到該位點的總讀段數的比值，大小范圍為0-1。若該參數為0，代表所有測到的讀段都來自被用作參考基因組的那個親本的基因組；該參數為1，代表所有讀段都來自另一個親本；該參數為0.5，則代表此混池中SNP來自兩個親本的基因組的頻率一致。將兩個池觀測到的SNP都計算出SNP-index，然后將兩個池的SNP-index值相減后得到Δ(SNP-index)，將Δ(SNP-index)對應該SNP所在染色體位置作圖，采用Δ（SNP-index）值的99%的置信區間篩選雄性不育基因候選區域。針對Δ(SNP-index)再做零假設，得出相應的p值，用于檢驗該數值的可信度，一般p＜0.05才認為有統計學意義。

在本發明的一個實施方案中，所述植株是黃瓜。

在本發明的一個實施方案中，所述分子標記是SNP標記。

在本發明的一個實施方案中，所述分子標記是InDel標記。