[發(fā)明專利]一種植物葉片離體培養(yǎng)保存方法及其應用

在審

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• 申請日: 2017-05-05
• 公開（公告）號: CN107151644A
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設計）人: 余安;鄭偉;余仲東
• 申請（專利權）人: 西北農(nóng)林科技大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01N1/02
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種植物葉片離體培養(yǎng)保存方法及其應用。

背景技術

植物葉片離體保存可為領域科學研究提供鮮活的研究樣品，常用于植物葉片的生理測定、遺傳測定以及病理學研究。

楊樹種類繁多，適應性強，生長快，是世界各國優(yōu)選的用材樹種和能源、木本飼料樹種。楊樹的引種、雜交和推廣栽培是我國林業(yè)建設的重要內(nèi)容之一。野外樣本的采集，是豐富楊樹品種、科學研究的必要環(huán)節(jié)；傳統(tǒng)的野外采集因時間、氣溫等限制，需要將樣本置冰壺等低溫設備中帶回，具有攜帶不方便、成本高、設備空間大、樣本存活時間短等缺點。

在楊樹的生理測定、遺傳測定、以及病理學研究中，采集楊樹葉片和進行室內(nèi)研究也面臨同樣的問題；為此G.P.Clinton等(1924)發(fā)明了葉盤法，用打孔器打取葉餅，50％的酒精表面消毒后漂洗2-3次，再置于1-1.5％的固體瓊脂培養(yǎng)基上面，密封培養(yǎng)皿后光照保存，該方法在進行生理、病理研究時具有接種菌種純度高、接種密度定量化、溫度及光照等實驗條件易控制、統(tǒng)計方便、易重復、與田間調(diào)查一致性好等優(yōu)點，但葉片損失大、自然壞死率高、容易被污染、葉盤壽命短、操作不方便等缺點。

隨后，Littlefield L.J.(1981)、Hitoshi Nakamura(1998)等先后對該方法進行了改進，國內(nèi)學者胡景江(2000)、田呈明(2002)、杜林(2005)等也先后對該方法進行了改進，但壞死和污染依然是研究中面臨的嚴重問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明實施例提供了一種植物葉片離體培養(yǎng)保存方法及其應用，主要目的是解決離體葉片培養(yǎng)時葉片損失大、自然壞死率高以及生命維持時間短的技術問題。

為達到上述目的，本發(fā)明主要提供了如下技術方案：

一方面，本發(fā)明實施例提供了一種植物葉片離體培養(yǎng)保存方法，所述方法包括如下步驟：選取整葉并留取葉柄作為預培養(yǎng)葉；

在玻璃皿底部的內(nèi)表面上鋪設培養(yǎng)紙，在所述培養(yǎng)紙上倒入培養(yǎng)液；

將所述預培養(yǎng)葉的正面與含有所述培養(yǎng)液的培養(yǎng)紙表面相對緊密放置，使所述預培養(yǎng)葉的葉柄部分緊貼于所述培養(yǎng)紙以吸收所述培養(yǎng)紙中的所述培養(yǎng)液；

用保鮮膜密封所述玻璃皿形成密封玻璃皿，將所述密封玻璃皿置于培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)；其中，所述培養(yǎng)室的恒溫溫度為25℃-28℃，每10h-14h交替選用黑暗或光照環(huán)境培養(yǎng)，所述密封玻璃皿內(nèi)的所述預培養(yǎng)葉的生命存活時間為25天-100天。

作為優(yōu)選，所述植物葉片為楊樹葉片；留取的葉柄長度為2cm-3cm，留取葉柄的目的是幫助葉片進行水份代謝以維持葉片生命力；所述楊樹優(yōu)選為青楊、黑楊及其雜交楊樹葉片。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)紙的面積為所述玻璃皿底部的內(nèi)表面面積的三分之一至二分之一，目的是使玻璃皿中的葉片正面能見到光；所述培養(yǎng)紙可以延伸至所述玻璃皿的側壁。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)紙為中性濾紙、普通家用衛(wèi)生紙或普通報紙；培養(yǎng)皿為普通的玻璃培養(yǎng)皿或一次性培養(yǎng)皿，保鮮膜或封口膜均可用作培養(yǎng)皿側壁的密封材料。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)液為赤霉素水溶液、普通自來水或無菌水；向所述培養(yǎng)紙上倒入所述培養(yǎng)液是指所述培養(yǎng)紙被所述培養(yǎng)液全部浸濕而無多余液體流出，即所述培養(yǎng)紙吸收所述培養(yǎng)液后基本達到飽和狀態(tài)以維持所述玻璃皿內(nèi)Rh為100％。

作為優(yōu)選，所述赤霉素水溶液的體積濃度為1-10‰克/升。

作為優(yōu)選，所述光照環(huán)境是采用燈光照明，所述燈光照明是采用5-8根功率為15瓦的LED燈管；所述燈管品牌為歐普燈管。

作為優(yōu)選，所述密封玻璃皿內(nèi)的相對濕度為100％以使葉片維持生命力，氣孔張開，有效進行光合作用；所述密封玻璃皿內(nèi)的所述預培養(yǎng)葉的生命存活時間為40天-60天。

作為優(yōu)選，所述相對放置指將所述預培養(yǎng)葉倒扣在所述培養(yǎng)紙上，所述預培養(yǎng)葉的正面是指本領域技術人員一致認同的葉片的一面，即顏色光亮鮮艷的一面，與葉片背面相對；將所述葉片倒扣于所述培養(yǎng)紙上后，最好用鑷子小心調(diào)整葉柄高度以使所述葉柄和濾紙充分接觸。

另一方面，本發(fā)明實施例提供了上述培養(yǎng)保存方法在植物種質(zhì)保存、植物遺傳測定、植物生理活性測定以及致病性測定中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：