[發明專利]一種用于快速檢測中藥材西紅花的LAMP引物及包含該引物的檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201710310960.1
• 申請日: 2017-05-06
• 公開（公告）號: CN107586865A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 趙明明;郭力城;劉思琪
• 申請（專利權）人: 寶童（固安）生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
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技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及中藥及中藥材鑒定領域，特別涉及一種西紅花環等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物組及包含此引物組的試劑盒。

背景技術

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭。又名藏紅花、番紅，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效。主產于西班牙、希臘、法國及中亞西亞一帶，我國于20世紀80年代引種并獲得成功，現在上海、江蘇、浙江、北京、等地有栽培，以上海為主產地。由于產量低，畝產不足兩公斤，故價格十分昂貴，根據西紅花質量的不同，每克零售價在40-100元不等，為牟取暴利，混偽、摻假現象層出不窮。為確保藥材市場中西紅花的質量及其臨床應用，須建立一種切實可行的鑒別方法。

常見西紅花的鑒別方法有性狀、理化、顯微、含量測定法，氣相色譜法、DNA分子技術等鑒別方法，這些方法各有優缺點，但這些方法均比較繁瑣，需要精密實驗設備和操作人員良好的生物學背景，不利于推廣。本發明針對西紅花及其混偽品的基因靶序列(psbA-trnH)差異位點設計特異引物，進行西紅花的分子鑒別，通過水浴鍋等恒溫保溫設備，保溫30分鐘，不需要進行基因測序和電泳分析，即可顯示結果。可更加快速、簡便、高效的鑒別西紅花真偽。

環介導等溫擴增技術(LAMP)是榮研化學Notomi等研發可取代PCR的一種簡便、快速、準確的基因擴增方法，可以在等溫條件下一步完成。LAMP技術的方法原理是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(60～65℃)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，直接靠擴增副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度判斷是否發生反應。短時間擴增效率可達到10⁹～10¹⁰個拷貝。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。本發明應用西紅花特異性鑒定引物組，利用LAMP技術開展西紅花快速檢測，特異性、靈敏度比普通變溫PCR方法更高，同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測西紅花的環介導等溫擴增引物組。本發明所提供的檢測西紅花的環介導等溫擴增引物，是以西紅花通用條形碼鑒定序列psbA-trnH為靶序列，設計可供環介導的等溫擴增技術進行的西紅花特異性鑒別引物：包括可以識別靶DNA四個不同序列的兩個內引物(正向內引物和反向內引物)，兩個外引物(正向外引物和反向外引物)，內引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈和兩個環引物。根據所設計的西紅花特異性鑒別引物組，建立了用于西紅花及其常見混偽品鑒別區分的環介導等溫擴增方法。其中所述的引物的序列如下：

CS-F3：5’-TTGTATGGCCAATCATTGTG-3’

CS-B3：5’-ATTCTATTGGACATAGAATGCC-3’

CS-FIP：

5’-ACTCAACATGAGGGAGGAGAAAGGGTATAATGGTAGATGCCCG-3’

CS-BIP：5’-TTCCCGATAAATGATTGGCTACAAAGGAGTAATCCGCTGTGA-3’

反應體系包括：2.5μL10×ThermoPol緩沖液，兩個內引物CS-FIP和CS-BIP的終濃度為1～2μM，兩個外引物CS-F3和CS-B3的終濃度為0.1～0.4μM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1-2.5mM，甜菜堿0.5-3M，待檢樣品DNA 100ng，Bst DNA聚合酶5-20U，鈣黃綠素1μL。混勻后在約63-68℃內保溫30-60min，然后80℃保溫10min。LAMP反應結束后，裸眼觀察被檢樣品LAMP反應產物的顏色，如果顏色為綠色或黃綠色則表示檢測藥材中存在西紅花，如果是桔色則表示檢測藥材不存在西紅花。

本發明所提供的西紅花檢測方法具有以下優點：(1)檢測時間短，1小時內即可獲得檢測結果，比現有的分子生物學檢測方法縮短數小時。(2)儀器要求寬松，不需要普通PCR所用的PCR儀、電泳槽及凝膠成像系統，只要一個水浴鍋即可完成檢測反應，可實現現場檢測。(3)操作簡單，整個過程不涉及復雜的儀器設備，不需要檢測人員的生物學背景知識，檢測結果清晰，只用肉眼觀察顏色即可判斷。(4)在本發明的LAMP反應體系中，加入了一種染料鈣黃綠素，該染料在反應液配置時加入，反應結束后，無需開蓋，直接根據顏色變化進行結果判定，能有效的降低污染的可能性。

附圖說明

圖1藥材西紅花及其偽品LAMP反應檢測結果