[發(fā)明專利]一種用于快速檢測中藥材西紅花的LAMP引物及包含該引物的檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710310960.1
• 申請日: 2017-05-06
• 公開（公告）號: CN107586865A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設計）人: 趙明明;郭力城;劉思琪
• 申請（專利權）人: 寶童（固安）生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
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1.一種西紅花檢測用引物組，所述引物組由下列引物組成：

CS-F3：TTGTATGGCCAATCATTGTG

CS-B3：ATTCTATTGGACATAGAATGCC

CS-FIP：ACTCAACATGAGGGAGGAGAAAGGGTATAATGGTAGATGCCCG

CS-BIP：TTCCCGATAAATGATTGGCTACAAAGGAGTAATCCGCTGTGA

2.一種用于西紅花藥材的檢測方法，該方法用于檢測藥材中是否存在西紅花，其特征在于以西紅花的psbA-trnH基因GenBank登陸號：KX108704.1核酸序列為靶序列，通過LAMP法用權利要求1所述引物組選擇性擴增所述靶基因，確認是否存在擴增產物。

3.根據權利要求2所述的西紅花藥材的檢測方法，其特征在于環(huán)介導的等溫擴增反應體系包括2.5μL 10×ThermoPol緩沖液，兩個內引物CS-FIP和CS-BIP的終濃度為1-2μM，兩個外引物CS-F3和CS-B3的終濃度為0.1-0.4μM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1-2.5mM，甜菜堿0.5-3M，待檢樣品DNA 1-100ng，Bst DNA聚合酶5-20U，鈣黃綠素1μL，反應程序擴增溫度63-68℃；所述檢測方法具體為：1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于西紅花藥材及其原植物；2)西紅花的環(huán)介導等溫擴增，取擴增反應液，先加待測模版，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為25μL的反應體系，混勻后在約63-68℃內保溫30-70min，然后80℃保溫10min；3)LAMP反應結束后，裸眼檢測被檢樣品LAMP反應產物的顏色，如果顏色為綠色或黃綠色則表示檢測藥材中存在西紅花，如果是桔色則表示檢測藥材不存在西紅花。

4.一種西紅花檢測用試劑盒，其特征在于由提取試劑A組成為0.5M氫氧化鈉、1％PVP(聚吡咯烷酮)、1％Triton X100(曲通X100)，中和試劑B組成為0.1M Tris-HCl，擴增試劑C三個組件組成，擴增試劑C每管22μL含2.5μL10×ThermoPol緩沖液，兩個內引物CS-FIP和CS-BIP的1.6μM，兩個外引物CS-F3和CS-B3，0.2μM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1.25mM，甜菜堿1M，13.9μL雙蒸水，試劑D為LAMP擴增所用Bst DNA聚合酶，試劑E組成為鈣黃綠素終濃度2.5μM；該試劑盒使用方法具體為：1)模板DNA制備：取1-3mg粉碎的樣品，加入20μL提取試劑A，充分混勻2min；加入80μL中和試劑B，離心3min；取20μL上清；加入80μL中和試劑B，離心3min；取1μL用作模板；2)LAMP反應及檢測：取擴增試劑C1管，加入1μL模板DNA及8U Bst DNA聚合酶及1μL實際E，混勻后在約63-68℃內保溫30-70min，然后80℃保溫10min；據權利要求3所述的西紅花檢測方法觀察LAMP反應產物顏色判別是否存在西紅花。