[發(fā)明專利]一種克氏原螯蝦染色體的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710309843.3
• 申請(qǐng)日: 2017-05-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107219104A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李艷和;石林林;張龍;周小云;王衛(wèi)民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克氏原螯蝦染色體的制備方法。

背景技術(shù)

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)，隸屬于甲殼綱，十足目，螯蝦科，原螯蝦屬，原產(chǎn)于墨西哥北部和美國(guó)南部。于1929年左右引入我國(guó)，目前該蝦已成為我國(guó)一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)作出了一定的貢獻(xiàn)。了解該蝦的染色體組型特征可以為進(jìn)一步研究該蝦的遺傳育種與品種改良以及控制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

由于克氏原螯蝦的染色體形態(tài)較小、數(shù)目較多，一般的染色體制備方法很難得到分散好、形態(tài)清晰可辨的染色體圖片，這給克氏原螯蝦的組型分析帶來(lái)一定的困難。已有三篇文獻(xiàn)報(bào)道了克氏原螯蝦的染色體研究情況，其中只有最早的一篇文獻(xiàn)給出了該蝦染色體的組型分析結(jié)果(Murofushi et al.Karyological study of the red swamp crayfish and the Japanese lobster by air-drying method.Proc.Japan Acad.,Ser.B,1984,60(B):306-309)，另兩篇文獻(xiàn)只給出了染色體分裂相的圖片，因染色體形態(tài)可辨性差沒(méi)有進(jìn)一步給出組型分析結(jié)果(朱越雄等，克氏原螯蝦染色體研究.水產(chǎn)養(yǎng)殖，1997，3：1-13；2.Radwan et al.Cytogenetic characterization and genetic variations between freshwater crayfish Procambarus clarkii in Egypt.RJPBCS,2014,5(2):1801-1816)。這三篇文獻(xiàn)給出的克氏原螯蝦染色體數(shù)目上存在一定的出入，文獻(xiàn)提到的制備染色體的組織多為精巢，而只有當(dāng)精巢處于生殖發(fā)育期才易得到中期分裂相。現(xiàn)有的方法限制了采樣的時(shí)間。因此，尋找一種更適合該蝦染色體的制備方法，且樣本采集時(shí)間不受季節(jié)限制，可為該蝦染色體數(shù)目的確定及其組型分析等研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)克氏原螯蝦染色體較小、數(shù)量較多、不易得到分散好的染色體分裂中期相、樣本采集時(shí)間受限制等問(wèn)題，提供一種染色體分散好，形態(tài)可辨且可數(shù)的改進(jìn)的克氏原螯蝦染色體的制備方法，本發(fā)明涉及的樣本采集時(shí)間不受季節(jié)的限制。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種克氏原螯蝦染色體制備方法，包括以下步驟：

(1)前期處理：按照克氏原螯蝦蝦體重6ug/g的劑量向肌肉內(nèi)注射植物血凝素(PHA)，間隔12h后按同樣劑量注射第二次，間隔3h后按5ug/g克氏原螯蝦蝦體重的劑量注射1mg/mL的秋水仙素，注射秋水仙素4h后取樣；

(2)利用離心法制備細(xì)胞：取蝦的觸角腺組織，置于生理鹽水中漂洗，然后放入有500uL生理鹽水的1.5mL離心管中，用小剪子將組織剪碎成泥狀，全部移入10mL試管，在500r/min下離心3min，離心后取上清液，在1000r/min下離心10min，棄上清液；

(3)低滲、預(yù)固定：用滴管將細(xì)胞吹散，緩慢加入0.75％KCl溶液至5mL，室溫下放置30min后加1mL的固定液-1，在1000r/min下離心10min，棄去上清液，留少許上清液，將細(xì)胞吹散；

(4)固定：加入5mL的固定液-1固定1.5h，中間更換3次固定液-1，每次在1000r/min下離心10min，最后一次留少許上清液，將細(xì)胞緩慢吹散后，加入適量固定液-2，將細(xì)胞混合均勻，30min后制片；

(5)噴片：將預(yù)冷的載玻片斜放，用滴管吸取適量的細(xì)胞懸液，垂直快而有力的噴到載玻片上，酒精燈火焰上快速烤2-3s后，在空氣下干燥；

(6)染色：采用瑞士-姬姆薩染色套組(購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司)，該染色套組分A液和B液，按A液和B液體積比為1:2配制)對(duì)附著有染色體的玻片進(jìn)行染色；

(7)在顯微鏡下觀察和拍照；

其中：

步驟(2)中的生理鹽水組分為：NaCl 7.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，NaHCO₂0.02g/L；

步驟(4)中的固定液-1為甲醇和冰醋酸按3:1體積比進(jìn)行配制；固定液-2為甲醇和冰醋酸按照1:1體積比進(jìn)行配制。固定液-1和固定液-2現(xiàn)用現(xiàn)配，置于冰上備用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：