[發明專利]一種克氏原螯蝦染色體的制備方法

在審

• 申請號: 201710309843.3
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN107219104A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 李艷和;石林林;張龍;周小云;王衛民
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種克氏原螯蝦染色體制備方法，其特征包括以下步驟：

(1)前期處理：按克氏原螯蝦體重6ug/g的劑量向肌肉內注射植物血凝素(PHA)，間隔12h后按同樣劑量注射第二次，間隔3h后按照5ug/g蝦體重的劑量注射1mg/mL的秋水仙素，注射秋水仙素4h后取樣；

(2)用離心法制備細胞：取克氏原螯蝦的觸角腺組織，置于生理鹽水中漂洗，然后轉移到盛有500uL生理鹽水的1.5mL離心管中，用小剪子將組織剪碎成泥狀，全部移入10mL試管，在500r/min下離心3min，離心后取上清液，在1000r/min下離心10min，棄上清液；

(3)低滲、預固定：用滴管將細胞吹散，緩慢加入0.75％KCl溶液至5mL，室溫下放置30min后加1mL的固定液-1，在1000r/min下離心10min，棄去上清液，留少許上清液，將細胞吹散；

(4)固定：加入5mL固定液-1固定1.5h，中間更換3次固定液-1，每次在1000r/min下離心10min，最后一次留少許上清液，將細胞緩慢吹散后，加入適量的固定液-2，將細胞混合均勻，30min后制片；

(5)噴片：將預冷的載玻片斜放，用滴管吸取適量的細胞懸液，垂直快而有力的噴到載玻片上，在酒精燈火焰上快速烤2-3s后，在空氣下干燥；

(6)染色：采用瑞士-姬姆薩染色套組，該姬姆薩染色套組分A液和B液，配制時按A液：B液的體積比為1：2進行混合，對附著有染色體的玻片進行染色；

(7)在顯微鏡下觀察和拍照；

其中：

步驟(2)中的生理鹽水組分為：NaCl 7.5g/L，CaCl2 0.2g/L，KCl 0.2g/L，NaHCO₂0.02g/L。

步驟(4)中的固定液-1為甲醇和冰醋酸按3:1體積比配制，固定液-2為甲醇和冰醋酸按1:1體積比進行配制。