[發明專利]一種淀粉樣多肽的純化方法

在審

• 申請號: 201710309635.3
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN107698674A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 王錫平;張中玉
• 申請（專利權）人: 蘇州強耀生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/20
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及多肽技術領域，尤其涉及淀粉樣多肽的純化方法。

背景技術

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，即俗稱的老年性癡呆，是一種中樞神經系統變性病，起病隱襲，病程呈慢性進行性，是老年期癡呆最常見的一種類型。主要表現為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經精神癥狀，嚴重影響社交、職業與生活功能。AD的病因及發病機制尚未闡明，目前比較公認的為淀粉樣蛋白級聯學說，該學說認為AD患者可能是由于淀粉樣蛋白前體基因和早老素基因等的突變，導致Aβ((β-淀粉樣蛋白)異常分泌和產生過多導致大量Aβ在腦組織內沉積，對周圍的突觸和神經元具有毒性作用，可破壞突觸膜，最終引起神經細胞死亡。Aβ沉積導致AD的其他病理變化，是AD發病的核心環節。減少Aβ的形成，抑制Aβ的沉積，是預防和治療AD的根本途徑。因此，如何預防Aβ的聚合以及得到Aβ較高純度的單體具有十分重大的作用，對阿爾茨海默病多肽(Peptide)的預防和治療可以做出重要的貢獻。

淀粉樣多肽純化比較困難，是由于多肽本身的性質決定的，在室溫下就很容易聚合。目前對淀粉樣多肽的制備方法報道很少，一般對Aβ加熱溶解，采用高效液相制備，但該方法無可避免的會導致在純化過程中Aβ已經聚合。純化凍干的Aβ還需要解聚處理。過程比較繁瑣，成本消耗較高。而且在純化過程中有可能導致樣品在制備柱中擴散，導致峰型較寬，分離效果差，得率偏低。

有鑒于上述的缺陷，本設計人，積極加以研究創新，以期創設一種淀粉樣多肽的純化方法，使其更具有產業上的利用價值。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種克服現有生產工藝的不足、解決了淀粉樣多肽在純化過程中容易聚合的問題的淀粉樣多肽的純化方法。

本發明的淀粉樣多肽的純化方法，包括淀粉樣多肽的溶解、反相色譜柱分析和反相制備色譜柱吸附及洗脫收集的步驟。

進一步的，所述溶解的步驟包括將淀粉樣多肽溶于溶劑中得到淀粉樣多肽溶液。

當作為反相色譜柱分析的梯度檢測時，溶解后得到的淀粉樣多肽溶液過濾后進行粗品分析檢測。

當作為反相制備色譜柱吸附及洗脫收集時，溶解后得到的淀粉樣多肽溶液用水稀釋到合適的比例，進行進樣吸附并洗脫收集。

進一步的，所述反相色譜柱分析的步驟包括將所述淀粉樣多肽溶液接反相色譜分析柱進行梯度檢測，得到分析圖譜。

反相梯度檢測分析條件為：

流動相：A液：0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液；B液：乙腈；

分析柱：Kromasil 100-5C18-MS 5um 4.6*250mm；

時間：0-20min；

流速：1mL/min；

A：B為：95-99：1-5到1-5：95-99；

波長：200-240nm。

進一步的，所述反相制備色譜柱吸附及洗脫收集包括以下步驟：

(1)根據所述分析圖譜設置制備色譜柱的制備梯度。

(2)將淀粉樣多肽溶液接制備色譜柱進行進樣吸附并洗脫收集。

(3)收集洗脫出來的所有峰進行質譜確認及產品純度檢測。

反相制備條件為：

流動相：A液0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，B液異丙醇；

時間：0-25min；

流速：20.00mL/min；

A：B為：95-65：5-35到5-35：65-95；

波長：200-240nm。

產品純度檢測條件為：

色譜柱為C18柱，柱子型號為Innoval ODS-2 5μm 4.6*250mm，

流動相：A液：濃度為0.1-0.2％三氟乙酸水溶液，B液：乙腈；

時間：0-20min；

流速：1.00mL/min；

A：B為：90-70：10-30到10-30：70-90；

波長：200-240nm；

進樣量：20μL。

進一步的，所述淀粉樣多肽為Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ42-1以及淀粉樣多肽Aβ1-42的衍生物，并分別具有如下的氨基酸序列：

人源Aβ1-42的氨基酸序列為：

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；

鼠源Aβ1-42的氨基酸序列為：