[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速高效篩選維生素K2（MK?7）高產(chǎn)菌的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710309437.7
• 申請(qǐng)日: 2017-05-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106916810A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃和;任路靜;羅苗苗;倪擎天;關(guān)榮鋒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N13/00
• 分類(lèi)號(hào): C12N13/00;C12N15/01;C12R1/07
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所32230
• 代理人: 蔡吉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速高效篩選維生素K2(MK-7)高產(chǎn)菌的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

維生素K2是一類(lèi)脂溶性凝血類(lèi)維生素，為甲萘醌類(lèi)系列化合物，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)上C-3位異戊二烯側(cè)鏈的長(zhǎng)短不同共有14種形式，以MK-n表示(n指?jìng)?cè)鏈上異戊二烯單位的個(gè)數(shù))，甲萘醌-4(MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)最為常見(jiàn)，而MK-7由于可快速被腸道吸收，在血液中的半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛研究。維生素K2在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療方面具有顯著的效果，被稱(chēng)為“第四代抗骨質(zhì)疏松產(chǎn)品”。除此之外，維生素K2還可以迅速改善由于維生素K缺乏引起的出血，抗動(dòng)脈鈣化及骨關(guān)節(jié)炎，抗腫瘤，延緩衰老，修復(fù)損傷細(xì)胞，治療帕金森癥等，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。維生素K2的應(yīng)用已得到了權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。2005年日本批準(zhǔn)維生素K2作為抗骨質(zhì)疏松藥物上市。我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局也將維生素K2列入“營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(試行)”的“維生素、礦物質(zhì)化合物名單”中(國(guó)食藥監(jiān)注[2005]202號(hào))，可用做保健食品或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的原料。2008年1月，維生素K2通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)安全認(rèn)定。2009年，歐洲議會(huì)和歐盟理事會(huì)決定在其所有成員國(guó)中，維生素K2可用作保健食品或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的原料(2009/345/EC)。

目前，國(guó)內(nèi)外維生素K2的專(zhuān)利主要涉及三方面內(nèi)容，一方面是發(fā)酵過(guò)程調(diào)控的優(yōu)化(EP1803820B1；CN104357355A)；一方面是維生素K2產(chǎn)物的分離提取(CN103898175A；US20060057688A1)；另一方面是菌種篩選，達(dá)能日爾維公司(法國(guó))采用桿菌肽或過(guò)氧化物使乳酸菌自然變種(US7981657B2)；上海紅馬飼料有限公司采用紫外和亞硝基胍復(fù)合誘變，結(jié)合原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選維生素K2高產(chǎn)菌株(CN102827798A)。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)維生素K2大多是都以化學(xué)合成法生產(chǎn)，由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)其產(chǎn)量太低，成本過(guò)高，無(wú)法作為批量生產(chǎn)的主要途徑，需要進(jìn)行誘變篩選提高產(chǎn)量。菌株篩選的方法一般為化學(xué)誘變法，物理誘變法，離子注入誘變法和原生質(zhì)體誘變法等。其中，常壓室溫等離子體(ARTP)誘變不僅可以對(duì)微藻、細(xì)菌、真菌、酵母等微生物進(jìn)行快速誘變，而且由于其正突變率高，與傳統(tǒng)誘變方式相比，更容易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的優(yōu)良突變菌。在大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，維生素K2(甲基萘醌類(lèi))是細(xì)胞內(nèi)唯一的內(nèi)源性親脂抗氧化劑，也是呼吸鏈中不可或缺的電子傳遞體。其作用效果和CoQ相似，通過(guò)維持線粒體DNA和基因的穩(wěn)定促進(jìn)細(xì)胞的生存，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔等起到獨(dú)立的抗凋亡作用。本發(fā)明擬采用ARTP方法對(duì)納豆芽孢桿菌的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，并針對(duì)抗反饋突變菌株(結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變菌)和抗呼吸鏈抑制劑的菌株的篩選進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比底物消耗速率、生物量和產(chǎn)量等方面，從而獲得高產(chǎn)菌株，為實(shí)現(xiàn)維生素K2的微生物發(fā)展的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，現(xiàn)有技術(shù)中菌種選育過(guò)程效率過(guò)低，無(wú)法獲取高產(chǎn)菌株；為了解決該問(wèn)題，本發(fā)明提供一種快速高效篩選維生素K2(MK-7)高產(chǎn)菌的方法。

具體的，本方案為：

一種快速高效篩選維生素K2高產(chǎn)菌的方法，其中，以納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)常壓室溫等離子體(ARTP)誘變?cè)季?，誘變后的菌株用含維生素K2結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的平板選育后，再在含呼吸鏈抑制劑的平板上進(jìn)行選育，并經(jīng)96孔培養(yǎng)板發(fā)酵復(fù)篩，獲取維生素K2高產(chǎn)菌。

本發(fā)明所述的方法，其中，具體步驟為：

(1)將納豆芽孢桿菌出發(fā)菌株在種子培養(yǎng)基中活化；

(2)將滅菌的金屬載片置于已滅菌的玻璃平板中，將活化后的納豆菌菌懸液均勻涂布于載片上，分別在ARTP-II型誘變機(jī)中進(jìn)行誘變；

(3)納豆菌菌懸液誘變完成后，將其用生理鹽水洗脫，并涂布在添加維生素K2結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)菌平板上，挑選出單菌落在96孔培養(yǎng)板中發(fā)酵，將維生素K2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏；

(4)將步驟(3)獲得的納豆芽孢桿菌活化后，均勻涂布在添加呼吸鏈抑制劑無(wú)菌平板上，挑選出單菌落在96孔培養(yǎng)板中發(fā)酵，將維生素K2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏。

本發(fā)明所述的方法，其中，所述步驟(2)中，常壓室溫等離子體誘變采用ARTP-II型誘變機(jī)，以時(shí)間為可變參數(shù)，功率設(shè)定為100W，氣流量設(shè)定為10SLM，調(diào)整誘變時(shí)間為30～150s。