[發(fā)明專利]一種快速高效篩選維生素K2（MK?7）高產(chǎn)菌的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710309437.7
• 申請(qǐng)日: 2017-05-04
• 公開（公告）號(hào): CN106916810A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃和;任路靜;羅苗苗;倪擎天;關(guān)榮鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N13/00
• 分類號(hào): C12N13/00;C12N15/01;C12R1/07
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所32230
• 代理人: 蔡吉

1.一種快速高效篩選維生素K2高產(chǎn)菌的方法，其特征在于，以納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)常壓室溫等離子體（ARTP）誘變?cè)季?，誘變后的菌株用含維生素K2結(jié)構(gòu)類似物的平板選育后，再在含呼吸鏈抑制劑的平板上進(jìn)行選育，并經(jīng)96孔培養(yǎng)板發(fā)酵復(fù)篩，獲取維生素K2高產(chǎn)菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟為：

（1）將納豆芽孢桿菌出發(fā)菌株在種子培養(yǎng)基中活化；

（2）將滅菌的金屬載片置于已滅菌的玻璃平板中，將活化后的納豆菌菌懸液均勻涂布于載片上，分別在ARTP-II型誘變機(jī)中進(jìn)行誘變；

（3）納豆芽孢桿菌菌懸液誘變完成后，將其用生理鹽水洗脫，并涂布在添加維生素K2結(jié)構(gòu)類似物無菌平板上，挑選出單菌落在96孔培養(yǎng)板中發(fā)酵，將維生素K2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏；

（4）將步驟（3）獲得的高產(chǎn)菌株活化后，均勻涂布在添加呼吸鏈抑制劑無菌平板上，挑選出單菌落在96孔培養(yǎng)板中發(fā)酵，將維生素K2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，常壓室溫等離子體誘變采用ARTP-II型誘變機(jī)，以時(shí)間為可變參數(shù)，功率設(shè)定為100W，氣流量設(shè)定為10SLM，調(diào)整誘變時(shí)間為30~150s。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在K2結(jié)構(gòu)類似物無菌平板中添加了2.5~20 mg/L 維生素K2結(jié)構(gòu)類似物，所述維生素K2類似物為1-羥基-2-萘甲酸、2-甲基-1,4-萘醌、對(duì)苯醌、1-萘酚中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）中，添加呼吸鏈抑制劑無菌平板中添加了5~200 mg/L呼吸鏈抑制劑，所述呼吸鏈抑制劑為魚藤酮和氰化物中的一種或多種。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，種子培養(yǎng)基為30 g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨，5g/L NaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，培養(yǎng)溫度37℃，120rpm培養(yǎng)1d。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為50g/L甘油、30g/L大豆蛋白胨、0.6g/L酵母粉、 0.3g/LK₂HPO₄、0.1 g/LCaCl₂·H₂O 、0.3g/LMgSO₄.7H₂O，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間3d。