[發(fā)明專利]一種特異性檢測(cè)人類微小病毒B19核酸的熒光PCR方法和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710308465.7
• 申請(qǐng)日: 2017-05-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058629A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方園;余圣良;周健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張家港藍(lán)蘇生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司32103
• 代理人: 汪青,周敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測(cè)人類微小病毒B19核酸的熒光PCR方法和試劑盒，能夠?qū)θ祟愇⑿〔《綛19核酸進(jìn)行定性檢測(cè)，可以作為有效的檢測(cè)工具。

背景技術(shù)

人類微小病毒B19(human parvovirus B19，簡(jiǎn)稱B19),屬細(xì)小病毒科，紅病毒屬，單鏈DNA病毒，全長(zhǎng)約5.6-kbp，是細(xì)小病毒中唯一對(duì)人類有致病性的病原體。B19病毒感染普遍存在，在不同年齡和免疫狀態(tài)的人群中臨床表現(xiàn)不同，常通過(guò)呼吸道、密切接觸和宮內(nèi)感染，也可通過(guò)輸血和血液制品傳播，以及血胎途徑垂直傳播，可引起兒童及成人的無(wú)癥狀感染、傳染性紅斑和關(guān)節(jié)炎，也可引起溶血性貧血患者一過(guò)性再生障礙性貧血危象和免疫缺陷患者的慢性貧血，有時(shí)引起血小板減少和血管性紫癜。其臨床表現(xiàn)廣泛而復(fù)雜，尤其是妊娠期婦女B19病毒宮內(nèi)感染可導(dǎo)致胎兒水腫、流產(chǎn)、甚至死胎等情況，是需重點(diǎn)解決的問(wèn)題。

臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)多采用血清學(xué)試驗(yàn)，如ELISA、RIA和IFA等，檢測(cè)特異性抗體。血清B19病毒-IgM陽(yáng)性證明近期感染己持續(xù)2～4個(gè)月。血清B19病毒-IgG陽(yáng)性則提示既往感染。由于B19病毒抗原來(lái)源困難，血清學(xué)試驗(yàn)尚難普及，而且某些人群感染病毒后抗體反應(yīng)很弱或不產(chǎn)生抗體，因此僅以抗體檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確判定B19病毒感染情況，需輔以抗原或核酸檢測(cè)結(jié)果作為診斷和治療的依據(jù)。目前比較成熟的核酸檢測(cè)方法是用熒光PCR方法，該方法克服了常規(guī)PCR法特異性差、易污染、結(jié)果分析操作步驟多等缺點(diǎn)，采用TaqMan方法或稱雙標(biāo)探針?lè)?熒光淬滅探針或稱FQ探針)，即在其5’端和3’端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。靶序列的特異性探針和特異性的PCR引物同時(shí)使用，設(shè)計(jì)的該探針在上下游PCR引物的范圍內(nèi)退火，由三個(gè)寡核苷酸共同結(jié)合于目的基因片段，使其特異性大大增強(qiáng)。在PCR的延伸階段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性將熒光報(bào)告基團(tuán)從探針上切割下來(lái)。隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，游離報(bào)告基團(tuán)的數(shù)量不斷的增加，實(shí)時(shí)檢測(cè)從游離熒光基團(tuán)上釋放的熒光信號(hào)，從而對(duì)靶序列進(jìn)行定性分析。該P(yáng)CR反應(yīng)在封閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，分析結(jié)果也無(wú)需開(kāi)封，因此，避免了PCR產(chǎn)物污染的發(fā)生。

目前，也有熒光PCR方法用于檢測(cè)人類微小病毒B19的報(bào)道，但是開(kāi)發(fā)更多有效、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光PCR方法用的引物和探針，并將此引物和探針用于檢測(cè)試劑盒也是本領(lǐng)域追求的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測(cè)人類微小病毒B19核酸的熒光PCR方法及試劑盒，該試劑盒具有靈敏、特異、反應(yīng)效率高的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)定性檢測(cè)人類微小病毒B19核酸的目的。

為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種特異性檢測(cè)人類微小病毒B19核酸的熒光PCR試劑盒，包括特異性引物對(duì)和探針，所述的特異性引物對(duì)為：

正向引物：5’-GCCGTGTGCACCCATTGTA-3’；

反向引物：5’-GGGCGTTTAGTTACGCATCCT-3’；

所述的探針為：5’-ACTCCCCACCGTGCCCTCAGC-3’。

本發(fā)明中，所述的探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光素或熒光染料，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。

具體地，所述的報(bào)告熒光素或熒光染料為FAM或其它任何可以作為探針標(biāo)記的熒光素或熒光染料；淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA或其它任何可以作為淬滅基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)。

優(yōu)選地，其它任何可以作為探針標(biāo)記的熒光素或熒光染料例如HEX、TET、JOE、Yakima Yellow、Cy3、Cy3.5、Cy5、NED、VIC、PET、ROX、LIZ、RED、Texas Red；其它任何可以作為淬滅基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)例如Dabcyl、BHQ1、BHQ2。

優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括陽(yáng)性質(zhì)控品，所述陽(yáng)性質(zhì)控品含人工合成序列，所述的人工合成序列為人工合成含所述B19病毒特異性引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的序列。該人工合成序列的內(nèi)容為：

GGTCATTTACCATATGTACTATATGACCCTACAGCTACAGATGCAAAACAA

CACCACAGACATGGATATGAAAAGCCTGAAGAATTGTGGACAGCCAAAAGC

CGTGTGCACCCATTGTAAACACTCCCCACCGTGCCCTCAGCCAGGATGCGT