[發(fā)明專利]一種檢測(cè)呼吸道病原體的LAMP引物組合物及其試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710305673.1
• 申請(qǐng)日: 2017-05-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107099619A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方雪恩;王欣珍;王雄;楊茜;孔繼烈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01;C12R1/35;C12R1/93
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所31272
• 代理人: 竺路玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)呼吸道病原體的LAMP引物組合物，以及基于微流控芯片系統(tǒng)的檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒及其方法。

背景技術(shù)

呼吸道感染是我國(guó)常見(jiàn)的一種傳染病，是指病原體感染人體的鼻腔、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng)。上呼吸道感染主要有病毒引起，指鼻腔、咽或喉部炎癥，最常見(jiàn)的是急性上呼吸道感染，有較強(qiáng)的傳染性也可引起嚴(yán)重并發(fā)癥。下呼吸道感染由病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體等微生物引起，下呼吸道感染包括支氣管炎、肺炎等，治療時(shí)若能明確引起感染的病原體，則可以選擇有效的抗生素或抗病毒治療。同時(shí)現(xiàn)今非典型呼吸道病原體在呼吸道病原體中占比越來(lái)越大，并且存在多重感染的情況。因此實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，多病原體檢測(cè)已成為趨勢(shì)。

目前臨床上應(yīng)用的鑒定病原體的方法主要是依靠培養(yǎng)檢測(cè)，但是培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間差，準(zhǔn)確性低，同時(shí)呼吸道病原體很多較難培養(yǎng)。而且該類疾病具有相似的臨床癥狀和流行性特征，并且存在多重感染的情況。

呼吸道聯(lián)檢試劑Pneumoslide為西班牙VIRCELL公司生產(chǎn)，1卡可同時(shí)檢測(cè)人血清中呼吸道感染9項(xiàng)IgM抗體，包括嗜肺軍團(tuán)菌1型(LP1)、肺炎支原體(MP)、Q熱立克次體(COX)、肺炎衣原體(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒(PIV)，但結(jié)果需用免疫熒光顯微鏡觀察，對(duì)辨別陰陽(yáng)性需要較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行分辨。

微流控技術(shù)是以微加工技術(shù)實(shí)現(xiàn)微體積反應(yīng)，用以取代常規(guī)分子生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)或藥物分析反應(yīng)，并可實(shí)現(xiàn)多通量或高通量反應(yīng)使得實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成本大幅降低，顯著提高效率。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增根據(jù)鏈置換DNA聚合酶的擴(kuò)增特性以及特異性引物(針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4條特異性引物)，利用鏈置換DNA聚合酶保證引物在等溫條件下順利與模板結(jié)合并進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)有等同的特異性和靈敏度，可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增，同時(shí)還可添加環(huán)引物，提高擴(kuò)增效率，優(yōu)于PCR。

相關(guān)呼吸道病原體檢測(cè)技術(shù)主要為間接免疫熒光法，膠體金法、酶聯(lián)免疫法以及熒光PCR法。其中，間接免疫熒光法判定結(jié)果需要借助熒光顯微鏡，而且判定結(jié)果需要檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)豐富；膠體金檢測(cè)雖然快速，但是靈敏度不高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。酶聯(lián)免疫檢測(cè)的特異性和靈敏度不高，操作過(guò)程繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力。熒光PCR法能夠較準(zhǔn)確的檢測(cè)病原體核酸，但多重?zé)晒釶CR產(chǎn)品檢測(cè)靶點(diǎn)最多3個(gè)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)體系和操作過(guò)程比較復(fù)雜，難以實(shí)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，需要專業(yè)人員操作特定檢測(cè)儀器等問(wèn)題。

目前許多研究將環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增與微流控芯片結(jié)合，對(duì)病原體核酸、腫瘤標(biāo)記基因、耐藥位點(diǎn)等進(jìn)行快速檢測(cè)，但是以上研究需要借助其他儀器對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

因此，目前面臨的技術(shù)性難點(diǎn)在于研發(fā)一款在可以同時(shí)檢測(cè)多種呼吸道病原體，并且便于判定結(jié)果的系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種用于檢測(cè)呼吸道病原體的LAMP引物組合物及其試劑盒和方法，其采用微流控芯片實(shí)現(xiàn)7種感染率較高的非典型呼吸道病原體(肺炎支原體(MP)、肺炎衣原體(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲/乙型流感病毒(IFA&IFB，共檢)、副流感病毒(PIV))的并行分析，并同步肉眼顯色判定，提高呼吸道相關(guān)病原體的檢測(cè)通量以及可操作性，降低成本，縮短檢測(cè)時(shí)間。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)呼吸道病原體的LAMP引物組合物，其包括肺炎支原體引物組、肺炎衣原體引物組、甲/乙型流感病毒引物組、副流感病毒引物組、腺病毒引物組、呼吸道合胞病毒引物組中的至少一組；

其中，所述肺炎支原體引物組包括SEQ ID NO：1所示的肺炎支原體外引物1、SEQ ID NO：2所示的肺炎支原體外引物2、SEQ ID NO：3所示的肺炎支原體內(nèi)引物1和SEQ ID NO：4所示的肺炎支原體內(nèi)引物2；

其中，所述肺炎衣原體引物組包括SEQ ID NO：5所示的肺炎衣原體外引物1、SEQ ID NO：6所示的肺炎衣原體外引物2、SEQ ID NO：7所示的肺炎衣原體內(nèi)引物1和SEQ ID NO：8所示的肺炎衣原體內(nèi)引物2；

其中，所述甲/乙型流感病毒引物組包括SEQ ID NO：9所示的甲/乙型流感病毒外引物1、SEQ ID NO：10所示的甲/乙型流感病毒外引物2、SEQ ID NO：11所示的甲/乙型流感病毒內(nèi)引物1和SEQ ID NO：12所示的甲/乙型流感病毒內(nèi)引物2；