[發(fā)明專利]一種海馬1H?NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法和用途

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710303116.6
• 申請日: 2017-05-03
• 公開（公告）號: CN107102021A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王佩義;郝晉琪;梁海東;秦雪梅;趙曉喆;趙思俊;田俊生;高曉霞
• 申請（專利權(quán)）人: 山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國藥有限公司
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及中藥指紋圖譜的構(gòu)建方法，特別涉及一種海馬的1H-NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法，及其在海馬質(zhì)量控制方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

海馬是近陸淺海小型魚類的一種，作為中藥有很強(qiáng)的醫(yī)學(xué)藥用價值，能夠溫腎壯陽、散結(jié)消腫，在龜齡集、復(fù)方皂礬丸等經(jīng)典復(fù)方中發(fā)揮治療作用，但目前海馬藥材市場混亂，良莠不齊，缺乏可靠的質(zhì)量監(jiān)控手段，不利于原料藥材的質(zhì)量控制。

2015版《中國藥典》收載藥用海馬五種，包括海龍科動物線紋海馬（Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder）、刺海馬（Hippocampus histrix Kaup）、大海馬（Hippocampus kuda Bleeker）、三斑海馬（Hippocampus trimaculatus Leach）和小海馬（海蛆，Hippocampus japonicus Kaup），而鑒別方法僅限于性狀、顯微鑒別，缺乏專屬性成分研究和具體的表征方法分析，對藥材質(zhì)量評價存在一定難度。核磁共振圖譜具有單一性，全面性，定量性和易辨性，能夠提供大量的特征信號，從多方面多角度來描述樣品的結(jié)構(gòu)特征，因此應(yīng)用核磁共振技術(shù)可以對含氫化合物進(jìn)行測定，監(jiān)測到多數(shù)有機(jī)化合物，能夠在整體水平進(jìn)行樣品分析，對海馬化學(xué)成分進(jìn)行全面表征。本發(fā)明的目的在于采用核磁共振技術(shù)建立一種方法簡單、操作便捷，可以對海馬進(jìn)行全面檢測分析，從而實(shí)現(xiàn)有效質(zhì)量控制的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有藥材質(zhì)量控制所面臨的局限性，提供一種能夠從整體水平較全面地表征海馬化學(xué)成分信息的1H-NMR指紋圖譜構(gòu)建方法，并實(shí)現(xiàn)對海馬的質(zhì)量控制。主要內(nèi)容如下：

一種海馬1H-NMR指紋圖譜的構(gòu)建方法，包含以下步驟：

（1）稱取海馬粉末于離心管中，分別加入超純水、甲醇、氯仿，渦旋，超聲提取，離心后取上層清液至圓底燒瓶，減壓濃縮蒸干；

（2）用氘代甲醇與緩沖重水溶解提取物，離心后移取上清液于核磁管中；

（3）將樣品在25℃下于600MHz NMR儀上測定，采用noesygppr1d脈沖序列，測定頻率600.13 MHz，掃描次數(shù)64次，譜寬12345.7Hz，脈沖時間14.0s，采樣時間2.6542s，弛豫時間1.0s，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536，F(xiàn)ID分辨率0.188Hz，以Methnol-d4進(jìn)行鎖場。

其中，緩沖重水為KH2PO4溶于D2O，以1mol·L-1 氘代氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH=6.0的含0.05% 3-（三甲基硅基）丙酸鈉鹽的溶液。

對由上述構(gòu)建方法得到的海馬1H-NMR圖譜進(jìn)行化學(xué)成分指認(rèn)鑒別，利用對照品對照并結(jié)合核磁共振譜峰化學(xué)位移及偶合常數(shù)進(jìn)行分析，確定海馬指紋圖譜的特征峰包括：異亮氨酸（=0.960.02，t，J=7.2Hz；=1.030.02，d，J=6.6Hz）、亮氨酸（=0.970.02，t，J=6.6Hz）、纈氨酸（=1.010.02，d，J=7.2Hz；=1.060.02，d，J=7.2Hz）、乳酸（=1.330.02，d，J=7.2Hz；=4.060.02，q，J=7.2Hz）、丙氨酸（=1.490.02，d，J=7.2Hz）、乙酸（=1.930.02，s）、谷氨酸（=2.100.02，m；=2.380.02，m）、琥珀酸（=2.450.02，s）、肌酸（=2.750.02，s）、膽堿（=3.220.02，s）、甜菜堿（=3.280.02，s）、牛磺酸（=3.410.02，t，J=6.6Hz）、甘氨酸（=3.510.02，s）、甘油（=3.540.02，dd，J=6Hz，11.4Hz；=3.630.02，dd，J=4.2Hz，11.4Hz）、乳糖（=5.190.02，d，J=3.6Hz）、延胡索酸（=6.530.02，s）、酪氨酸（=6.850.02，d，J=8.4Hz；=7.180.02，d，J=8.4Hz）、腺嘌呤（=8.180.02，s）、肌苷（=8.220.02，s）、甲酸（=8.470.02，s）。

上述海馬指紋圖譜構(gòu)建方法可用于海馬的品質(zhì)評價和質(zhì)量控制，具體包括：

（1）可用于區(qū)分不同海馬品種，包括以下步驟：收集不同品種海馬樣本，按照上述方法對各海馬進(jìn)行測試和圖譜處理，得到不同品種海馬的1H-NMR指紋圖譜；以步長δ0.02ppm對各海馬指紋圖譜進(jìn)行分段積分，積分段為δ-0.11～9.01，其中δ4.75～5.05（殘余水峰）、δ3.29～3.33（殘余甲醇峰）不進(jìn)行積分，將積分后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件中進(jìn)行PCA（主成分）分析。