[發明專利]一種豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201710301560.4
• 申請日: 2017-05-02
• 公開（公告）號: CN107064502B
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 尹雙輝;楊順利;蔡建平;尚佑軍;袁莉
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/577;G01N21/31;G01N21/78
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 張克勤

1.一種用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒進行檢測的方法，所述方法為非疾病診斷方法，其特征在于：使用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒，包括預包被SPA蛋白的檢測板、血清樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液、四種病原的陰陽性標準對照血清、以及HRP分別標記的CSFV的 E2抗原、PCV2的Cap抗原、PrV的gB和gE抗原；

所述HRP標記的CSFV的E2抗原、PCV2的Cap抗原、PrV的gB和PrV的gE抗原使用濃度分別為1∶4000、1∶4000，1∶4000、1∶2000，其對應的質量濃度為0.1μg/mL-15μg/mL；

具體包括以下步驟：

(1）加入血清樣本：將待檢測血清樣本、陰陽性標準對照血清均以原倍濃度100μL/孔加入對應孔中，陰陽性標準對照血清做復孔；密封,室溫作用60min；

(2）去除非特異性反應：用質量濃度為1% EDTA的去污洗滌液和50 mmoL/L的磷酸鹽緩沖液，以100μL/孔室溫作用5 min，棄去孔內液體，磷酸鹽緩沖液的pH 值為7.2；

(3）洗板：棄凈孔內殘余EDTA和PBS液體，用200-300μL/孔的1×PBST洗滌液連續洗滌4次，最后一次棄凈孔內液體，拍干；

(4）加入HRP-標記抗原：根據需要檢測病原的抗體，加入已滴定好HRP標記抗原，100μL/孔，37 ℃作用1h，洗滌；

(5） 加入底物顯色：以100μL/孔的用量加入TMB底物緩沖液，室溫避光顯色15 min，以100μL/孔的用量加入終止液；

(6）結果判定：

試驗成立條件：計算陽性對照、陰性標準對照血清各孔的平均吸光度值OD450nm，當陽性標準血清平均OD450≥1.0，陰性標準血清OD450≤0.20，判定為試驗結果成立；

判定：當待測樣品OD450/陰性標準血清OD450≥2.10，判定該血清樣品為檢測病原的抗體陽性；當待測樣品OD450/陰性標準血清OD450＜2.10，判定該血清樣品為檢測的病原抗體陰性。

2.根據權利要求1所述的用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒進行檢測的方法，其特征在于:所用的TMB底物緩沖液組成為，底物溶液A：TMB DMSO溶液，濃度為2-6mg/mL；底物溶液B：15-30g/L醋酸鈉，檸檬酸1-9g/L，30%雙氧水0.1-1ml，蒸餾水溶解至1L。

3.根據權利要求1所述的用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒進行檢測的方法，其特征在于：所述預包被SPA蛋白的檢測板所包被SPA蛋白的包被量為2ng～28ng/孔，包被稀釋液為50 mmol/L的pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液。

4.根據權利要求3所述的用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒進行檢測的方法，其特征在于:所述預包被SPA蛋白的檢測板中包被用碳酸鹽緩沖液每毫升的組成為1.59mg Na₂CO₃和2.93mg NaHCO₃，去離子水充分溶解后保存于4℃溫度下。

5.根據權利要求4所述的用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒進行檢測的方法，其特征在于:所述預包被SPA蛋白的檢測板中采用的封閉液組分為質量濃度為1-5%海藻糖、質量濃度0.5-2.0%明膠、體積濃度1-8%馬血清，1×PBST，pH 7.3，200μl/孔。

6.根據權利要求5所述的用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒進行檢測的方法，其特征在于:所述洗滌液為體積濃度為0.5%的吐溫-20的0.1mol/L的pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液。

7.根據權利要求6所述的用豬病毒性傳染病血清IgG抗體多重ELISA檢測試劑盒進行檢測的方法，其特征在于: 所述終止液為1.5mol/L H₂SO₄。