[發明專利]基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法

有效

• 申請號: 201710298329.4
• 申請日: 2017-05-01
• 公開（公告）號: CN107084938B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 陳偉;林秀玲;鄧豪華;劉銀環;彭花萍
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

本發明公開一種基于殼聚糖?鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法，其特征是利用堿性磷酸酶水解抗壞血酸磷酸酯生成抗壞血酸，影響殼聚糖?鉑模擬氧化酶/3，3’，5，5’?四甲基聯苯胺鹽酸鹽催化顯色反應體系，結合溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，直接用于堿性磷酸酶及其抑制劑含量的測定。在0.5~20 U/L范圍內，吸光度值A₄₅₀與堿性磷酸酶濃度呈線性關系，檢測限為0.34 U/L。本發明操作簡便、靈敏度高，能夠作為分析方法應用于環境及生命科學體系中堿性磷酸酶及其抑制劑含量的測定。

技術領域

本發明涉及殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色體系的堿性磷酸酶及其抑制劑的測定方法，屬于分析化學和納米技術領域。

背景技術

堿性磷酸酶是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶，它是判斷一些肝膽疾病的重要指標，尤其是黃疸的鑒別診斷。堿性磷酸酶作為一種能夠將對應底物去磷酸化的酶，通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，生成磷酸根離子和自由羥基，這類底物包括核酸、蛋白和生物分子等。因為堿性磷酸酶的去磷酸化作用，使得它在分子生物學和酶聯免疫分析中得到了廣泛應用，臨床上使用它來水解克林霉素磷酸酯，生成的克林霉素具有抗生作用。在免疫試劑產品中，堿性磷酸酶被作為最常用的標記酶之一，與辣根過氧化物酶相比，堿性磷酸酶用作標記酶具有高穩定性，高靈敏度等優點。隨著堿性磷酸酶的運用越來越廣泛，對于堿性磷酸酶的檢測也變得愈加重要。目前，我國對堿性磷酸酶檢測方法的種類還相對單一，因此建立一種新型且可行的測定堿性磷酸酶的方法在當下的科學研究中具有重要的實際意義。

本發明以抗壞血酸磷酸酯為堿性磷酸酶底物，以殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧氣氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系為檢測信號源，建立了一種比色測定堿性磷酸酶的方法。本法操作簡便、靈敏度高、抗干擾能力強、重現性好，有望用于實際臨床診斷。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧氣氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系，以抗壞血酸磷酸酯為堿性磷酸酶底物，從而測定堿性磷酸酶及其抑制劑的方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯和堿性磷酸酶反應產物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應后加入硫酸溶液終止反應，根據溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于堿性磷酸酶含量的測定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1 g殼聚糖溶解于50 mL濃度為1v/v %的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2 m/v %的殼聚糖溶液，將2mL濃度為10 mmol/L氯鉑酸加入到47 mL濃度為0.2 m/v %殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1 mL濃度為0.2 mol/L新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法，其特征是將50 μL濃度為4 mmol/L的抗壞血酸磷酸酯和50 μL不同濃度的堿性磷酸酶加入到200 μL pH為 9.10，濃度為10 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘，然后依次加入632.5 μL pH為 5，濃度為50 mmol/L的醋酸鹽緩沖液、50 μL濃度為3 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和17.5 μL殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200 μL濃度為2 mol/L的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值A₄₅₀。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法，其特征是在0.5 ~ 20U/L范圍內，吸光度A₄₅₀與堿性磷酸酶濃度呈線性關系，檢測限為0.34 U/L。