[發明專利]基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法

有效

• 申請號: 201710298329.4
• 申請日: 2017-05-01
• 公開（公告）號: CN107084938B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 陳偉;林秀玲;鄧豪華;劉銀環;彭花萍
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

1.一種非疾病診斷目的的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯和堿性磷酸酶反應產物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應后加入硫酸溶液終止反應，根據溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于堿性磷酸酶含量的測定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1 g殼聚糖溶解于50 mL濃度為1 v/v %的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2 m/v %的殼聚糖溶液，將2 mL濃度為10 mmol/L氯鉑酸加入到47 mL濃度為0.2 m/v %殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1 mL濃度為0.2 mol/L新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶。

2.根據權利要求1所述的一種非疾病診斷目的的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法，其特征是將50 μL濃度為4 mmol/L的抗壞血酸磷酸酯和50 μL不同濃度的堿性磷酸酶加入到200 μL pH為 9.10，濃度為10 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘，然后依次加入632.5 μL pH為 5，濃度為50 mmol/L的醋酸鹽緩沖液、50 μL濃度為3 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和17.5 μL殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200 μL濃度為2 mol/L的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值A₄₅₀。

3.根據權利要求1或2所述的一種非疾病診斷目的的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶測定方法，其特征是在0.5 ~ 20 U/L范圍內，吸光度A₄₅₀與堿性磷酸酶濃度呈線性關系，檢測限為0.34 U/L。

4.一種基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶抑制劑的測定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯、堿性磷酸酶和堿性磷酸酶抑制劑的反應產物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應后加入硫酸溶液終止反應，根據溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于堿性磷酸酶抑制劑的抑制率的測定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1g殼聚糖溶解于50 mL濃度為1 v/v %的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2 m/v %的殼聚糖溶液，將2 mL濃度為10 mmol/L氯鉑酸加入到47 mL濃度為0.2 m/v %殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1 mL濃度為0.2 mol/L新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液。

5.根據權利要求4所述的一種基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的堿性磷酸酶抑制劑的測定方法，其特征是將50 μL濃度為4 mmol/L的抗壞血酸磷酸酯和50 μL濃度為0.4 U/mL的堿性磷酸酶溶液加入到200 μL含不同濃度苯丙氨酸的pH為 9.10，濃度為10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘，依次加入632.5 μL pH為 5，濃度為50 mmol/L的醋酸鹽緩沖液、50 μL濃度為3 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和17.5 μL殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200 μL濃度為2 mol/L的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值A₄₅₀，計算抑制率，通過軟件擬合得到苯丙氨酸的IC₅₀為0.77 mmoL/L。