[發(fā)明專利]高抗癌活性T細(xì)胞的篩選方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710294588.X
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN108795858A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張長風(fēng)
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳賓德生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強(qiáng)

本發(fā)明提供了一種高抗癌活性T細(xì)胞的篩選方法，包括以下步驟：提供分離的人外周血單個核細(xì)胞；提供CD25抗體包被磁珠；檢測CD3和CD25雙陽性細(xì)胞的比例；使用CD25抗體包被磁珠來篩選去掉CD25陽性細(xì)胞，得到目標(biāo)細(xì)胞亞群。本發(fā)明首次采用CD25抗體包被磁珠來負(fù)篩選具有高抗癌活性的T細(xì)胞特定亞群，簡便易操作，成本低，便于得到離體生長情況好、再刺激擴(kuò)增性強(qiáng)、腫瘤殺傷能力高且持久的高品質(zhì)細(xì)胞免疫產(chǎn)品。本發(fā)明還提供了該篩選方法在免疫細(xì)胞治療中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高抗癌活性T細(xì)胞的篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

免疫細(xì)胞療法是一種新興的腫瘤治療模式，已經(jīng)成為全球的研究熱點(diǎn)，特別是以腫瘤浸潤細(xì)胞(TIL)、CAR-T(嵌合抗原受體T細(xì)胞)/TCR-T(嵌合型T細(xì)胞)技術(shù)為主要代表，成為全球生物醫(yī)學(xué)的主要發(fā)展方向。免疫細(xì)胞療法是運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑從患者體內(nèi)分離免疫細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、激活和擴(kuò)增后，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，直接殺傷或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤目的。

現(xiàn)有的細(xì)胞免疫療法均使用未經(jīng)篩選的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，以此法得到的未經(jīng)篩選的PBMC，含有包括免疫細(xì)胞療法所需要的殺傷性T細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞療法不需要的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。同時，殺傷性T細(xì)胞又可根據(jù)其表型分為幼稚型、中樞記憶型、效應(yīng)記憶型、效應(yīng)型等多個表型，其形態(tài)功能、擴(kuò)增性、細(xì)胞因子分泌能力等均有很大差別。換言之，未經(jīng)篩選的外周血單個核細(xì)胞中只有幼稚型、中樞記憶型T細(xì)胞才適合生產(chǎn)免疫細(xì)胞產(chǎn)品(此類細(xì)胞可稱為“目標(biāo)細(xì)胞亞群”)，而不加篩選的使用單個核細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)不僅會導(dǎo)致人力、物力成本上升，而且無用的細(xì)胞亞群還有可能影響目標(biāo)細(xì)胞亞群的功能，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量下降。

因此，有必要提供一種生產(chǎn)成本低，且能高效篩選出高抗癌活性的目標(biāo)T細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種高抗癌活性T細(xì)胞的篩選方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中免疫細(xì)胞中無用細(xì)胞亞群多、目標(biāo)細(xì)胞亞群少且活性低、質(zhì)量差的問題。

第一方面，本發(fā)明提供了一種高抗癌活性T細(xì)胞的篩選方法，包括以下步驟：

(1)提供CD25抗體包被磁珠；提供分離的人外周血單個核細(xì)胞；

(2)檢測CD3和CD25雙陽性細(xì)胞的比例：

將步驟(1)中分離出的人外周血單個核細(xì)胞重懸在X-VIVO 15無血清培養(yǎng)基中，得到第一細(xì)胞重懸液；向所述第一細(xì)胞重懸液中加入第一熒光染料標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體與第二熒光染料標(biāo)記的鼠抗人CD3抗體，孵育15-50min，采用流式細(xì)胞儀檢測所述孵育后的細(xì)胞中CD3與CD25雙陽性細(xì)胞的百分比；

(3)使用CD25抗體包被磁珠篩選CD25陰性目標(biāo)細(xì)胞亞群：

將步驟(1)中分離出的人外周血單個核細(xì)胞，采用X-VIVO 15無血清培養(yǎng)基重懸，得到第二細(xì)胞重懸液；根據(jù)所述CD3和CD25雙陽性細(xì)胞的比例，將所述CD25抗體包被磁珠按照與雙陽性細(xì)胞的個數(shù)比為(2-5):1的比例加入到所述第二細(xì)胞重懸液中，混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40-60min；

將所得培養(yǎng)混合液在施加磁場的情況下靜置，吸出上清液，并撤去磁場；向所得上清液中加入X-VIVO 15無血清培養(yǎng)基重懸，得到含CD25陰性目標(biāo)細(xì)胞亞群的懸浮液，即，含高抗癌活性T細(xì)胞的懸浮液。