[發明專利]高抗癌活性T細胞的篩選方法和應用

在審

• 申請號: 201710294588.X
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN108795858A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 張長風
• 申請（專利權）人: 深圳賓德生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

1.一種高抗癌活性T細胞的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提供CD25抗體包被磁珠；提供分離的人外周血單個核細胞；

(2)檢測CD3和CD25雙陽性細胞的比例：

將步驟(1)中分離出的人外周血單個核細胞重懸在X-VIVO 15無血清培養基中，得到第一細胞重懸液；向所述第一細胞重懸液中加入第一熒光染料標記的鼠抗人CD25抗體與第二熒光染料標記的鼠抗人CD3抗體，孵育15-50min，采用流式細胞儀檢測所述孵育后的細胞中CD3與CD25雙陽性細胞的百分比；

(3)使用CD25抗體包被磁珠篩選CD25陰性目標細胞亞群：

將步驟(1)中分離出的人外周血單個核細胞，采用X-VIVO 15無血清培養基重懸，得到第二細胞重懸液；根據所述CD3和CD25雙陽性細胞的比例，將所述CD25抗體包被磁珠按照與雙陽性細胞個數比為(2-5):1的比例加入到所述第二細胞重懸液中，混勻后，置于細胞培養箱中培養40-60min；

將所得培養混合液在施加磁場的情況下靜置，吸出上清液，并撤去磁場；向所得上清液中加入X-VIVO 15無血清培養基重懸，得到含CD25陰性目標細胞亞群的懸浮液，即，含高抗癌活性T細胞的懸浮液。

2.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，分離的人外周血單個核細胞中CD3陽性的細胞比例≥50％。

3.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，若分離的人外周血單個核細胞中CD3陽性的細胞比例小于50％，則：

向所述分離的人外周血單個核細胞中，加入CD3免疫磁珠富集得到CD3陽性的T細胞，之后再進行步驟(2)和(3)。

4.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述CD25抗體包被磁珠是采用以下方法制得：

a、將負載磁珠采用pH為6.0-10.0的第一緩沖溶液進行洗滌、重懸，向重懸后的負載磁珠中加入抗人CD25抗體，在18-37℃下避光孵育16-24h；向所得避光孵育液中加入封閉劑，以封閉掉磁珠上未結合抗體的位點，之后再孵育10-30min，得到含CD25抗體包被磁珠的反應液；

b、對所述反應液靜置，棄去上清液，對所得CD25抗體包被磁珠采用第二緩沖溶液進行清洗數次，并重懸于所述第二緩沖溶液，得到純化后的CD25抗體包被磁珠，其中，所述第二緩沖溶液為含有牛血清白蛋白和EDTA的pH＝7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液。

5.如權利要求4所述的篩選方法，其特征在于，步驟(a)中，所述CD25抗體與所述負載磁珠的加入比例為(150-300μg):(4×10⁷個)。

6.如權利要求4所述的篩選方法，其特征在于，步驟(a)中，所述封閉劑包括牛血清白蛋白、甘氨酸、賴氨酸和精氨酸中的一種或多種；所述封閉劑在所述避光孵育液中的質量體積濃度為0.01-0.1％。

7.如權利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述第二緩沖溶液中，EDTA的濃度為0.5-5mM；牛血清白蛋白的質量體積濃度為0.02-0.2％。

8.如權利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述負載磁珠包括粒徑1nm-500μm的普通磁珠。

9.如權利要求8所述的篩選方法，其特征在于，所述負載磁珠為M-450Epoxy磁珠，其粒徑為2-10μm。

10.如權利要求1-9任一項所述的篩選方法在免疫細胞治療中的應用。