[發明專利]梨果皮全紅芽變性狀位點的分子標記及其引物和應用

在審

• 申請號: 201710294106.0
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN106929594A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 薛華柏;李秀根;楊健;王龍;王蘇珂;蘇艷麗;張慧蓉;曹玉芬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所;中國農業科學院果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司41111
• 代理人: 陳大通

1.一種梨果皮全紅型芽變性狀位點的InDel分子標記，其特征在于，該InDel分子標記為In1579-1，所述的分子標記In1579-1的InDel位點位于梨基因組登錄號為NW_008988579.1的scaffold上的23081bp處，插入缺失序列為ATTATTTTTTTA或ATTATTTTTTTATTTTTTTA。

2.根據權利要求1所述的梨果皮全紅型芽變性狀位點的InDel分子標記，其特征在于，所述分子標記In1579-1的擴增產物序列為：CATGTTACAGGTCCAACCTTCTTTCCTTTTATTATTTTTTTAAATGTTTTTGGATTCTGGATTTCAGATTGCAATAGG以及CATGTTACAGGTCCAACCTTCTTTCCTTTTATTATTTTTTTATTTTTTTAAATGTTTTTGGATTCTGGATTTCAGATTGCAATAGG中的一個或兩個。

3.一種權利要求1或2所述梨果皮全紅型芽變性狀位點的InDel分子標記的引物，其特征在于，所述InDel分子標記In1579-1的引物序列為：

上游引物序列為：5'-CATGTTACAGGTCCAACCTT-3'，

下游引物序列為：5'-CCTATTGCAATCTGAAATCC-3'。

4.一種梨果皮全紅型芽變性狀位點的InDel分子標記，其特征在于，該InDel分子標記為In1400-1，分子標記In1400-1的InDel位點位于梨基因組登錄號為NW_008988400.1的scaffold上161533bp處，插入缺失序列為G或GTTA。

5.根據權利要求4所述的梨果皮全紅型芽變性狀位點的InDel分子標記，其特征在于，所述分子標記In1400-1的擴增產物序列為：CAAGGACCAAAGTCACGTATTAGTTATTATCTAAACGGTAAGACTTTTTCTTTTTACATTTTGATCCATCAAGATTTCAAATTCCTCCAAATAGTACTCTTTTCCTAAAGTCGAAGA以及CAAGGACCAAAGTCACGTATTAGTTATTATCTAAACGGTAAGACTTTTTCTTTTTACATTTTGATCCATCAAGATTTCAAATTCCTCCAAATAGTTATACTCTTTTCCTAAAGTCGAAGA中的一個或兩個。

6.一種權利要求4或5所述梨果皮全紅型芽變性狀位點的InDel分子標記的引物，其特征在于，所述InDel分子標記In1400-1的引物序列為：

上游引物序列為：5'-CAAGGACCAAAGTCACGTAT-3'，

下游引物序列為：5'-TCTTCGACTTTAGGAAAAGAGT-3'。

7.根據權利要求1或4所述的梨果皮全紅型芽變性狀位點的InDel分子標記，其特征在于，所述的梨果皮全紅型芽變性狀位點命名為Red，位于梨的第四號染色體上，位于登錄號為NW_008988579.1的組裝scaffold和登錄號為NW_008988400.1的組裝scaffold及其之間的基因組范圍內。

8.權利要求1所述的梨果皮全紅型芽變性狀位點Red的InDel分子標記In1579-1、權利要求4所述梨果皮全紅型芽變性狀位點Red的InDel分子標記In1400-1在紅皮梨輔助選擇育種中的應用。

9.權利要求1或權利要求4所述的InDel分子標記在紅皮梨輔助選擇育種中的應用，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以果皮全紅型芽變品種‘T109’為母本、‘紅早酥’為父本進行雜交得到F₁單株；

(2)采用常規的CTAB法提取步驟(1)所得雜交組合群體F₁單株幼嫩葉片的DNA；

(3)以InDel分子標記In1579-1或InDel分子標記In1400-1的引物對為引物對步驟(2)所述的DNA進行聚合酶鏈式反應，得到擴增產物；

(4)將步驟(3)得到的擴增產物在8％非變性聚丙烯酰氨凝膠上進行電泳分離分析；然后根據電泳條帶的標記基因型判斷雜交組合群體F₁單株的紅皮表型和綠皮表型，并根據育種目標選擇雜種后代。

10.根據權利要求9所述的InDel分子標記在紅皮梨輔助選擇育種中的應用，其特征在于，步驟(3)所述的聚合酶鏈式反應的反應體系和反應程序如下：

所述聚合酶鏈式反應的擴增體系為20μL的反應體系：Ex Taq 0.1μL；10×Buffer 2μL；dNTPs(2.5mM each)1.6μL；Forward Primer(10μM)0.6μL；Reward Primer(10μM)0.6μL；DNA(10ng/μL)1μL，加入雙蒸餾水補足至20μL；

所述聚合酶鏈式反應的反應程序為：98℃預變性20s；30個循環的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃條件下保溫。