[發(fā)明專利]一種基于膠體金法檢測(cè)尿液中HIV（1+2）抗體試劑

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710293795.3
• 申請(qǐng)日: 2017-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106970219A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張誌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京金豪制藥股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所(普通合伙)11130
• 代理人: 王為,孟旭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種體外診斷試劑及其使用方法，特別涉及一種檢測(cè)人尿液中HIV(1+2)抗體的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有HIV尿液抗體檢測(cè)試劑，用的是酶聯(lián)免疫法，該方法僅限于檢測(cè)HIV-1抗體，且需要專用的儀器設(shè)備，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，必須由專業(yè)人員操作。

研發(fā)一種快速的并能用于自檢的HIV(1+2)尿液抗體檢測(cè)試劑是有必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種基于膠體金法檢測(cè)尿液中HIV(1+2)抗體試劑的制備方法，以膠體金標(biāo)記的SPA偶聯(lián)抗人IgG抗體制備膠體金結(jié)合物墊，作為顯色探針，在硝酸纖維素膜上混合包被gp41抗原和gp36抗原，作為檢測(cè)HIV 1型抗體和HIV 2型抗體的檢測(cè)線。

其中的膠體金結(jié)合物墊的制備方法如下：

1)標(biāo)記SPA，以0.2M碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金PH在8.2左右，10～30μg/ml 金的比例加入SPA,反應(yīng)30～60分鐘后，以BSA或PEG進(jìn)行封閉，封閉液的終濃度1～10mg/ml，10000rpm離心10～60分鐘，棄上清，沉淀用含有2mg/ml BSA的10mM Tris-Hcl(pH8.2)緩沖液的復(fù)溶至原體積。

2)金標(biāo)SPA偶聯(lián)抗人IgG抗體，在上述復(fù)溶后的金標(biāo)SPA溶液中，每毫升溶液中加入抗人IgG抗體0.1～10μg，反應(yīng)60min，10000rpm 離心10～60分鐘，棄上清，沉淀用含0.5％BSA、5％蔗糖、0.1％Triton X-100、0.03％proclin-300的10mM Tris-Hcl(pH8.2)的緩沖液復(fù)溶至原體積。

3)冷凍干燥，將上述金標(biāo)溶液鋪金后，-50℃預(yù)凍2小時(shí)后，抽真空進(jìn)行升華凍干，制備膠體金結(jié)合物墊。

其中的膠體金結(jié)合物墊，通過(guò)金標(biāo)SPA偶聯(lián)抗人IgG抗體，使抗人 IgG抗體的有序性增強(qiáng)，即Fab端一致向外，增加有效抗體的數(shù)量，增強(qiáng)其結(jié)合尿液中游離蛋白的能力，同時(shí)，通過(guò)金標(biāo)SPA偶聯(lián)抗人 IgG，延長(zhǎng)金標(biāo)探針的手臂，增強(qiáng)其反應(yīng)能力，提升產(chǎn)品的靈敏度。其中，在硝酸纖維素膜上混合包被的gp41抗原濃度為0.5～2.5mg/ml, gp36抗原濃度為0.1～0.5mg/ml。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)體系，所述檢測(cè)體系主要包括，SPA，膠體金，BSA，PEG，Tris-Hcl緩沖液，抗人IgG，蔗糖，Triton X-100， proclin-300等成分。

本發(fā)明所述檢測(cè)體系即實(shí)施例中所述檢測(cè)卡，檢測(cè)卡包括硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊，吸水紙、膠板和塑料卡殼等，檢測(cè)卡設(shè)有檢測(cè)線顯示部分和樣本加樣孔，其中的金標(biāo)墊按照本發(fā)明方法制備。

其他所需物品如鋁箔袋、塑瓶、干燥劑、說(shuō)明書(shū)也屬于本發(fā)明的范疇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、通過(guò)金標(biāo)SPA并偶聯(lián)抗人IgG抗體，使抗體的有序性增強(qiáng)，即 Fab端一致向外，增加有效抗體的數(shù)量，增強(qiáng)其結(jié)合尿液中游離蛋白的能力。通過(guò)金標(biāo)SPA偶聯(lián)抗人IgG抗體，延長(zhǎng)金標(biāo)探針的手臂，增強(qiáng)其反應(yīng)能力，提升產(chǎn)品的靈敏度。

2、檢測(cè)效率提高，與酶免尿檢試劑相比，檢測(cè)時(shí)間顯著縮短，結(jié)果 15min判讀；

以下為本發(fā)明技術(shù)方案和現(xiàn)有技術(shù)方案實(shí)施效果比較表：

附圖

圖1生產(chǎn)工藝流程圖

圖2檢測(cè)結(jié)果的判定

圖3陽(yáng)性尿20例檢測(cè)結(jié)果：

圖4陰性尿20例檢測(cè)結(jié)果：

圖5均一性試驗(yàn)結(jié)果：

圖6本發(fā)明檢測(cè)卡示意圖

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

具體實(shí)施的關(guān)鍵步驟如下：

步驟一：取100ml 40nm膠體金溶液，金濃度0.03％，加入1ml 0.2M 碳酸鉀，攪拌中加入4ml SPA(5mg/ml)，反應(yīng)60分鐘后，加入1ml 20％BSA，反應(yīng)60分鐘，10000rpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用含有2mg/ml BSA的10mM Tris-Hcl(pH8.2)緩沖液復(fù)溶至100ml。步驟二：在上述復(fù)溶后的金標(biāo)SPA溶液中，加入抗人IgG抗體100μl (10mg/ml)，反應(yīng)60min，10000rpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用含0.5％BSA、5％蔗糖、0.1％Triton X-100、0.03％proclin-300的10mM Tris-Hcl(pH8.2)緩沖液復(fù)溶至100ml。