[發(fā)明專利]一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710292036.5
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN107167598B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜毓君;滿朝新;潘瑞麗
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/559
• 分類號: G01N33/559;G01N33/569
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發(fā)明公開了一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及其應(yīng)用，屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明試劑盒包括酶標(biāo)孔、信號增強(qiáng)型試紙條、第一金標(biāo)抗體和第二金標(biāo)抗體；信號增強(qiáng)型試紙條的檢測線上包被有抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體，控制線上包被有羊抗鼠二抗；第一金標(biāo)抗體上包被有抗阪崎克羅諾桿菌檢測抗體，且由BSA封閉結(jié)合位點；第二金標(biāo)抗體上包被有抗BSA抗體；第一金標(biāo)抗體和第二金標(biāo)抗體結(jié)合形成雙金標(biāo)抗體。本發(fā)明的試劑盒靈敏度高，較傳統(tǒng)型試紙條靈敏度提高了100倍，穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)，檢測時間短，制作簡便且成本低，方便攜帶，為現(xiàn)場快速檢測阪崎克羅諾桿菌提供了有效工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及其應(yīng)用，屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

阪崎克羅諾桿菌屬克羅諾桿菌屬，是一種重要的食源性致病菌，能夠引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血病等。盡管由阪崎克羅諾桿菌引發(fā)的發(fā)病率非常低，但它的致死率可達(dá)80％，并且幸存的患者經(jīng)常會留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遺癥以及發(fā)育障礙。在多起阪崎克羅諾引起的疾病事件中調(diào)查發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾感染與嬰幼兒配方奶粉存在密切的關(guān)系。因此建立一種快速高效檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌的方法尤為重要。

目前常用的傳統(tǒng)分離檢測方法，需要經(jīng)過前增菌、選擇性培養(yǎng)、生理生化鑒定等，需5-7天才能確定目標(biāo)菌種，耗時長、勞動量大。因此需要發(fā)展一種簡單快速、靈敏特異的方法來進(jìn)行致病菌的檢測，迅速發(fā)展起來的PCR、LAMP、ELSA、生物傳感器、電化學(xué)等檢測方法，雖然具有較好的靈敏度和特異性，但是要求具有專業(yè)技能、程序繁瑣、還需要利用昂貴的實驗儀器，而且無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。

近年來快速發(fā)展的膠體金免疫層析試紙條操作簡便、檢測快速、結(jié)果可直接肉眼判讀、不需大型儀器、便于攜帶，可用于現(xiàn)場檢測，已成為基層篩選的有效工具。然而由于傳統(tǒng)的膠體金試紙條存在靈敏度低的問題，導(dǎo)致其廣泛應(yīng)用受到了限制。現(xiàn)在提高膠體金試紙條靈敏度的方法多采用金增強(qiáng)、銀增強(qiáng)等，檢測完成后需引入額外的檢測程序，且用到的還原劑鹽酸羥胺、對苯二酚屬有毒試劑；使用雙重膠體金進(jìn)行信號放大相對簡便，但是目前常用的兩者結(jié)合方式有生物素/鏈酶親和素放大，需要在同一膠體金上標(biāo)記兩種物質(zhì)，標(biāo)記方式復(fù)雜，且存在不確定因素，影響檢測的穩(wěn)定性；DNA分子雜交的方式，耗時長，易造成自組裝折疊，而且多采用將兩種金標(biāo)抗體直接分別噴在兩個結(jié)合墊上的方式，使得兩種膠體金不能夠很好地結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)合體。因此迫切需要提供一種簡便有效提高傳統(tǒng)試紙條檢測靈敏度的方法，實現(xiàn)簡便、快速檢測阪崎克羅諾桿菌。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有傳統(tǒng)試紙條靈敏度低，現(xiàn)有的提高靈敏度的方式標(biāo)記方式復(fù)雜、穩(wěn)定性差、需要引入有毒試劑安全性低、耗時長的問題，本發(fā)明提供了一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及應(yīng)用，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括酶標(biāo)孔A、信號增強(qiáng)型試紙條、第一金標(biāo)抗體C和第二金標(biāo)抗體D；所述信號增強(qiáng)型試紙條包括樣品墊1、結(jié)合墊2、NC膜3、吸水墊4和底板5，所述NC膜3上設(shè)有檢測線6和控制線7，所述檢測線6上包被有抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體，所述控制線7上包被有羊抗鼠二抗；所述第一金標(biāo)抗體C上包被有抗阪崎克羅諾桿菌檢測抗體，且由BSA封閉結(jié)合位點；所述第二金標(biāo)抗體D上包被有抗BSA抗體；所述第一金標(biāo)抗體C和第二金標(biāo)抗體D結(jié)合形成雙金標(biāo)抗體，結(jié)構(gòu)原理圖如圖1所示。

優(yōu)選地，所述第一金標(biāo)抗體(C)和第二金標(biāo)抗體(D)的體積均為6uL-9uL，第一金標(biāo)抗體(C)和第二金標(biāo)抗體(D)按照體積比為1：1結(jié)合形成雙金標(biāo)抗體。

更優(yōu)選地，所述第一金標(biāo)抗體C和第二金標(biāo)抗體D是按照8uL第一金標(biāo)抗體C與8uL第二金標(biāo)抗體D結(jié)合形成雙金標(biāo)抗體。

優(yōu)選地，所述第一金標(biāo)抗體C中膠體金粒徑為26nm-42nm；所述第二金標(biāo)抗體D中膠體金粒徑為26nm-54nm。