[發明專利]一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710292036.5
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN107167598B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 姜毓君;滿朝新;潘瑞麗
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: G01N33/559
• 分類號: G01N33/559;G01N33/569
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種利用快速檢測阪崎克羅諾桿菌試劑盒檢測阪崎克羅諾桿菌的方法，其特征在于，所述快速檢測阪崎克羅諾桿菌試劑盒包括酶標孔(A)、信號增強型試紙條、第一金標抗體(C)和第二金標抗體(D)；所述信號增強型試紙條包括樣品墊(1)、結合墊(2)、NC膜(3)、吸水墊(4)和底板(5)，所述NC膜(3)上設有檢測線(6)和控制線(7)，所述檢測線(6)上包被有抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體，所述控制線(7)上包被有羊抗鼠二抗；所述第一金標抗體(C)上包被有抗阪崎克羅諾桿菌檢測抗體，且由BSA封閉結合位點；所述第二金標抗體(D)上包被有抗BSA抗體；所述第一金標抗體(C)中膠體金粒徑為26nm；所述第二金標抗體(D)中膠體金粒徑為42nm；

所述檢測阪崎克羅諾桿菌的方法包括如下步驟：

1)在酶標孔(A)中加入100uL樣品液和8uL第一金標抗體(C)，室溫下孵育4min；

2)再向酶標孔(A)中加入8uL第二金標抗體(D)，混勻，由此所述第一金標抗體(C)和第二金標抗體(D)結合形成雙金標抗體；

3)將信號增強型試紙條插入酶標孔(A)中進行檢測，10min后觀察檢測結果；

4)判定方法：若信號增強型試紙條的檢測線(6)、控制線(7)都出現紅色條帶，表明樣品液中含有阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線(6)未出現紅色條帶，控制線(7)出現紅色條帶，表明樣品液中不含有阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線(7)未出現紅色條帶，表明試紙條失效；其中檢測線(6)顏色越深，表明樣品液中含有的阪崎克羅諾桿菌濃度越高。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一金標抗體(C)的制備方法為：每1ml膠體金溶液加入碳酸鉀調節溶液PH值后加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％BSA 100uL，混勻，室溫靜置反應1h以上；離心后去掉上清，加150uL復溶液復溶沉淀并混勻即得所述第一金標抗體(C)。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二金標抗體(D)的制備方法為：每1ml膠體金溶液加入碳酸鉀調節溶液PH值后加入抗BSA抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％100uL的人血清白蛋白，混勻，室溫靜置反應1h以上；離心后去掉上清，加150uL復溶液復溶沉淀并混勻即得所述第二金標抗體(D)。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測線(6)上包被的抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體的濃度為1.8mg/mL；所述控制線(7)上包被的羊抗鼠二抗的濃度為0.6mg/mL。

5.一種利用快速檢測阪崎克羅諾桿菌試劑盒檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌的方法，其特征在于，所述快速檢測阪崎克羅諾桿菌試劑盒包括酶標孔(A)、信號增強型試紙條、第一金標抗體(C)和第二金標抗體(D)；所述信號增強型試紙條包括樣品墊(1)、結合墊(2)、NC膜(3)、吸水墊(4)和底板(5)，所述NC膜(3)上設有檢測線(6)和控制線(7)，所述檢測線(6)上包被有抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體，所述控制線(7)上包被有羊抗鼠二抗；所述第一金標抗體(C)上包被有抗阪崎克羅諾桿菌檢測抗體，且由BSA封閉結合位點；所述第二金標抗體(D)上包被有抗BSA抗體；所述第一金標抗體(C)中膠體金粒徑為26nm；所述第二金標抗體(D)中膠體金粒徑為42nm；

所述檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌的方法包括以下步驟：

1)100g乳粉和900ml預熱的NB培養基混合后，前增菌5h，取10ml離心后，去除干凈上清及奶皮，將沉淀用1mL生理鹽水復溶；

2)取步驟1)所得樣品溶液100uL及第一金標抗體(C)8uL于酶標孔(A)中孵育4min后加入第二金標抗體8uL(D)，混勻，由此所述第一金標抗體(C)和第二金標抗體(D)結合形成雙金標抗體；

3)將信號增強型試紙條插入步驟2)中的酶標孔(A)中，10min后觀察檢測結果；

4)判定方法：若信號增強型試紙條的檢測線(6)、控制線(7)都出現紅色條帶，表明乳粉中含有阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線(6)未出現紅色條帶，控制線(7)出現紅色條帶，表明乳粉中不含有阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線(7)未出現紅色條帶，表明試紙條失效；其中檢測線(6)顏色越深，表明乳粉中含有的阪崎克羅諾桿菌濃度越高。