[發明專利]一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201710291561.5
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN107102148A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 肖一紅;劉思當;商營利;曹勝亮;蔡新娜
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/561;G01N33/535
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業)37240
• 代理人: 李茜

技術領域

本發明涉及動物病毒抗體檢測方法領域，本發明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測方法及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種急性傳染病，是一種以引起母豬繁殖障礙和各日齡豬呼吸疾病為特征的高度接觸性傳染病，主要特征表現為懷孕母豬食欲不振、持續性發熱、流產、早產、木乃伊胎及弱仔等癥狀以及哺乳仔豬和育成豬的高死亡率和呼吸系統疾病等，此外，通常還表現為部分發病的愈后母豬屢配不孕、發情不典型等癥狀。目前該病已成為危害世界養豬業的首要傳染病之一。該病不但缺乏治療的有效藥物，而且現有的疫苗也不能有效控制PRRSV感染，致使PRRS不斷暴發流行。

酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種廣泛應用在測定液體樣本中的蛋白、抗體或激素的免疫分析技術，具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。適用于量大臨床標本的同時檢測。ELISA是對PRRSV疫苗免疫后機體抗體效價評價的主要方法，也是對PRRSV感染情況進行監控的最常用的方法之一。目前所建立的ELISA檢測方法大多采用PRRSV全病毒或表達的核衣殼(N)蛋白作為抗原，最常用的為商品化美國IDEXX試劑盒。但我們在應用IDEXX試劑盒對臨床血清樣品檢測中發現，個別豬只即使免疫過PRRSV弱毒疫苗3周后仍然檢測不到抗體，發明人分析出現這種原因有以下2個方面，一個是機體不產生PRRSV的抗體，二是現有的檢測方法不能檢測到，這就導致了檢測的準確率大大下降。有抗體檢測不到，無法監控其體內的抗體產生情況，容易造成假陰性而在此免疫，造成誤判，制定不合理免疫程序，造成疫病發生，從而帶來經濟損失。因此如何克服現有檢測方法存在的上述缺陷成為急需解決的問題。

發明內容

針對現有技術的上述情況，本發明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測方法及其應用，首先將HP-PRRSV HuN4疫苗毒株的非結構蛋白NSP4克隆入pET-28a(+)原核表達載體中進行低溫誘導呈可溶性表達，利用His標簽進行純化，純化后的蛋白作為包被抗原，優化建立間接ELISA方法；并確定臨界值為0.406，利用優化建立的ELISA方法檢測1274份臨床豬血清，陽性率為71.59％，同時與美國IDEXX試劑盒檢測結果比較，陽性率符合率達到92％，其中4％的血清(50/1274)用IDEXX試劑盒檢測為陰性而用本發明中的技術則檢測為陽性，說明本發明所提供的檢測方法準確率高，可用于臨床血清樣品的常規檢測。

發明人針對背景技術中存在的問題，最終決定利用更換包被抗原的方式來嘗試解決，發明人應用多個PRRSV的病毒蛋白作為包被抗原建立ELISA方法，最終經過多次驗證后發現，非結構蛋白NSP4作為包被抗原時能檢測到現有技術中N蛋白檢測不到的PRRSV抗體，因此本發明提供的方法彌補了現有的國內外檢測方法的不足，將更有利于PRRSV抗體檢測及PRRSV流行的監控。

本發明的具體技術方案是：

1.根據GenBank(登陸號：EF635006)收錄的HP-PRRSV HUN4疫苗毒株全基因組核苷酸序列，設計并合成了一對用于擴增HP-PRRSV HUN4疫苗毒株NSP4基因的引物，引物如下：

F-5’-CCCGCTAGCGGTATTTCAGACTCA-3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其中引入了Nhe I酶切位點；

R-5’-CCCTCGAGTTCCGTTGGGTTTGGC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；引入了Xho I酶切位點；

擴增片段經膠回收純化后，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

2.目的蛋白的純化

將合成的基因片段用限制性內切酶Nhe I和Xho I雙酶切后連接入pET-28a(+)載體，轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞，加入1mM IPTG，30℃誘導5h，收集菌體，用SDS-PAGE檢測表達情況，結果發現在該條件下，表達的NSP4蛋白出現在裂解上清中，呈可溶性表達。而可溶性表達更能模擬蛋白自然特性，省去了蛋白復性的繁瑣過程。用南京金斯瑞生物科技有限公司的鎳柱純化試劑盒對蛋白進行純化。

3.ELISA條件優化

對ELISA過程中的每一步驟進行優化，其優化的結果為：