[發明專利]一種地黃蛋白納米顆粒及其制備方法

有效

• 申請號: 201710287433.3
• 申請日: 2017-04-27
• 公開（公告）號: CN107412730B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 丁偉;柯李晶;周建武;饒平凡
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61K9/19;A61P39/06;C07K14/415;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;G01N30/02;A61K36/804
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明公開了一種地黃蛋白及其納米顆粒的制備方法，顆粒由兩個蛋白組成，兩個地黃蛋白的N?端一級結構序列分別為SEQ ID NO:1：R?E?K?D?I?A?G?A?V?Q?T?V和SEQ ID NO:2：R?E?K?D?I?V?X。本發明涉及的地黃蛋白提取分離于鮮地黃、生地黃或熟地黃中，在這些傳統使用的地黃原料中穩定存在；其納米顆粒的制備方法不涉及任何交聯劑，且其成品廣泛存在于各類使用地黃為原料加以傳統熱加工工藝制作的湯劑中，為廣大人群服用多年，安全性高。本發明涉及的地黃蛋白納米顆粒除安全高效發揮自身功效外，還有望與其它原料配伍，高效協同發揮作用。

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域中的蛋白藥物新劑型和制劑技術，具體涉及到一種地黃蛋白納米顆粒及其制備方法。

背景技術

近幾十年來，納米顆粒研究廣泛，經過材料的納米化后，納米材料的物化性質（光學、電學、表面活性等）均會呈現與原始材料截然不同的性質，有靶向性和穿透性等優點的同時，也暴露出在生物相容性、細胞毒性和可降解性方面的缺點。目前應用于納米藥物載體研究的生物大分子（如血清白蛋白、絲蛋白等）皆沒有可以參照的天然研究模型，獲得納米顆粒的物化性質及其相關生物安全性也需要長期的觀測，才能得到全面評估。納米藥物載體發展帶來的潛在風險引起了科學界廣泛的擔憂。

地黃是一種我國人民長期使用的食品原料和中藥藥材，地黃在中藥湯劑，特別是中藥復方湯劑中具有非常重要的用途。地黃來源于玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosaLibosch）的塊根，具有調節免疫、抗腫瘤、抗輻射、保護胃粘膜、抗衰老等藥理作用，臨床上用于止血，并用于治療糖尿病、心腦血管疾病及高血壓等。鮮地黃中梓醇含量較高，約為5.33%，相當于生地黃的10倍，熟地黃的35倍，鮮地黃和生地黃性寒，味甘苦，清熱生津，涼血止血，養陰生津；熟地黃糖基化蛋白含量高，性微溫，味甘，滋陰補血，益精填髓。由于地黃藥理作用的多樣性及臨床應用的廣泛性，值得進一步深入研究和開發。但是到目前為止，有關地黃蛋白納米顆粒的研究國內外尚未見文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種地黃蛋白納米顆粒及其制備方法。針對化合物在納米化后，在安全性上的不確定性，本發明涉及的地黃蛋白納米顆粒的設計從兩個“天然”體系出發：一是天然存在于食品中的蛋白質成分，二是該蛋白質的納米化過程發生在熱加工過程，其納米顆粒存在于各種傳統加工湯劑中被廣泛服用。本發明得到的地黃蛋白納米顆粒體外細胞實驗顯示了極低毒性，強抗氧化活性，表面規則，粒徑分布均勻，穩定性好。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種地黃蛋白納米顆粒，由兩個地黃蛋白組成，由13個地黃蛋白DHP1單體和11個地黃蛋白DHP2單體形成一個球狀的蛋白納米顆粒；所述的地黃蛋白DHP1和DHP2的N-端一級結構序列分別為SEQ ID NO:1：R-E-K-D-I-A-G-A-V-Q-T-V和SEQ ID NO:2：R-E-K-D-I-V-X。

2、根據權利要求1所述的一種地黃蛋白納米顆粒，其特征在于：該納米顆粒其平均粒徑為120.61±0.46 nm，表面電荷呈負性，范圍在-18±5mV。

所述的地黃蛋白分子量分別為26.2 kDa（DHP1）和18.1KDa（DHP2）；等電點分別為8.0（DHP1）和5.2（DHP2）。

兩個地黃蛋白的提取方法，經過磷酸鹽緩沖液水相抽提后，DHP1經過弱陽離子交換色譜CM-Sephadex C-50和高效液相色譜Souce-15Q分離；DHP2經過兩步POROS 20 MicronHP2疏水色譜分離，從地黃中得到兩個電泳純的地黃蛋白。其具體包括以下步驟：