[發明專利]一種地黃蛋白納米顆粒及其制備方法

有效

• 申請號: 201710287433.3
• 申請日: 2017-04-27
• 公開（公告）號: CN107412730B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 丁偉;柯李晶;周建武;饒平凡
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61K9/19;A61P39/06;C07K14/415;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;G01N30/02;A61K36/804
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種地黃蛋白納米顆粒，其特征在于：由兩個地黃蛋白組成，由13個地黃蛋白DHP1單體和11個地黃蛋白DHP2單體形成一個球狀的蛋白納米顆粒；所述的地黃蛋白DHP1和DHP2的N-端一級結構序列分別為SEQ ID NO:1：R-E-K-D-I-A-G-A-V-Q-T-V和SEQ ID NO:2：R-E-K-D-I-V-X；

所述的地黃蛋白提取方法，具體包括以下步驟：

1）地黃蛋白粗提液的制備：鮮地黃經榨汁機、生地或熟地黃原料經高速粉碎機將其磨碎，料液比1:3加入0.2 mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液混合均勻，置于4℃，攪拌浸提24 h；用8層紗布過濾得到的地黃浸提液，棄去濾渣，將濾液在4 ℃下經15000rpm離心20 min，收集上清液；在4℃磁力攪拌條件下，向地黃蛋白抽提液中緩慢加入無水硫酸銨，使溶液鹽濃度達到20%，待完全溶解后，4℃下靜置4 h，以12000 rpm離心20 min，收集上清液；繼續向收集的上清液中緩慢加入無水硫酸銨至飽和度為40%，待完全溶解后，于之前同樣步驟收集上清液；繼續向上清液加入硫酸銨至飽和度為60%，待固體全溶后，于之前同樣步驟收集上清液；繼續向上清液加入硫酸銨至飽和度為80% ，待固體全溶解后，4 ℃下放置4h，15000 rpm離心20 min，收集沉淀；沉淀用0.2 mol/L、pH7.0磷酸緩沖液充分溶解后以相同濃度pH7.0磷酸緩沖液透析12h，將透析液在15000 rpm，4℃條件下，離心20 min，收集上清液，得到的溶液即為地黃蛋白粗提液；

2）地黃蛋白DHP1的離子交換色譜分離：將100mL地黃蛋白初提液流加至以0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸鈉緩沖液平衡的CM-Sephadex C-50弱陽離子常壓色譜柱，以同樣濃度醋酸-三水合醋酸鈉緩沖液繼續平衡3倍柱體積后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸鈉緩沖液線性梯度洗脫300 mL，最后用1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸鈉緩沖液洗脫1個柱體積，流速0.5mL/min，紫外分光光度計測量波長為280 nm，經過色譜分離的組分以自動分布收集儀收集，后以SDS-PAGE進行蛋白成分鑒定，獲得P0蛋白組分；將經CM-Sephadex C-50分離且透析過的P0蛋白組分進一步用Source-15Q高效液相色譜柱進行分離，5ml加至以0.02 mol/L、pH7.0磷酸緩沖液平衡的Source-15Q色譜柱，以同樣濃度的磷酸緩沖液繼續平衡3倍柱體積后，再以含0～01mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH7.0磷酸緩沖液線性梯度洗脫20 mL，最后用含1 mol/LNaCl 的0.02 mol/L、pH7.0磷酸緩沖液洗脫1個柱體積，流速1 mL/min，紫外分光光度計測量波長為280 nm，經過色譜分離的組分以自動分布收集儀收集，后以SDS-PAGE進行蛋白成分鑒定；

3）地黃蛋白DHP2的二步疏水色譜分離：將地黃蛋白粗提液進一步用疏水色譜POROS 20Micron HP2進行純化，疏水色譜柱以含有2 mol/L（NH₄）₂SO₄的0.02 mol/L、pH7磷酸緩沖液平衡，以2～0 mol/L（NH₄）₂SO₄的0.02 mol/L、pH7的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；流速2.0 mL/min，上樣量：5 mL，紫外檢測波長280 nm，經過色譜分離的組分以自動分布收集儀收集，后以SDS-PAGE進行蛋白成分鑒定；將第一次疏水色譜分離得到的蛋白組分按上述相同條件進行第二次疏水色譜分離，經過色譜分離的組分以自動分布收集儀收集，后以SDS-PAGE進行蛋白成分鑒定；

4）地黃蛋白的基本性質表征：以SDS-PAGE測定該經純化得到的地黃蛋白的分子量大小，以等電點聚焦測定該地黃蛋白的等電點，以Edman degradation測定地黃蛋白的N-端一級結構序列。

2.根據權利要求1所述的一種地黃蛋白納米顆粒，其特征在于：該納米顆粒其平均粒徑為120.61±0.46 nm，表面電荷呈負性，范圍在-18±5mV。