[發(fā)明專利]一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710284515.2
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN107090502B
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張富麗;牛蓓;宋君;雷紹榮;郭靈安;常麗娟;尹全;王東;劉文娟
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 成都眾恒智合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51239
• 代理人: 王育信

本發(fā)明公開了一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中僅針對真菌來進行冬蟲夏草鑒定從而缺乏足夠準(zhǔn)確性的問題。本發(fā)明在同一PCR反應(yīng)體系中同時檢測蟲草菌的ITS和蟲草菌寄主的COI基因核酸片段，用于鑒定所述COI基因核酸片段的擴增引物組為：COI?F：GGAAATCCHGGATCTTTAATTCOI?R：GATGCCCCMGARTGTGCAAT；用于鑒定所述ITS的擴增引物組為：CITS?F10’：GTTGCCTCGGCGGGACCITS?R10’?2：CMTTTGCTTGCTTCTTGACTGAG。本發(fā)明方法操作簡便，針冬蟲夏草的鑒別特異性強，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適宜推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測方法。

背景技術(shù)

冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis sym.Cordyceps) 為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲蝙蝠蛾幼蟲上的子座(子實體) 及幼蟲尸體的復(fù)合體。它是藥食兩用的名貴滋補藥材，主要分布于青藏高原海拔3000 m的雪線以上的地區(qū)，具有補肺益腎、平喘祛痰、鎮(zhèn)靜提神、強心壯血的功效，在增強免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化炎癥等方面均具有較好的藥理作用，具有極高的藥用和經(jīng)濟價值。由于其對生長地理環(huán)境的特殊要求，及其嚴(yán)格的寄生性，無法進行人工培植和規(guī)模化生產(chǎn)替代，自然資源十分稀少，市場供給極為短缺。加之近年來對野生蟲草的過渡采挖極大地破壞了蟲草生境，蟲草資源逐年驟減，使其得顯得十分珍貴，價格昂貴。在利益的驅(qū)使下，不法商販采取摻假、造假的手段牟利，從而使市場上充斥著各種各樣的偽品。常見的有亞香棒蟲草、涼山蟲草、新疆蟲草、地蠶及模制仿品等，這些偽品外觀與冬蟲夏草相似，但藥用價值和營養(yǎng)價值相差甚遠(yuǎn)，對蟲草的用藥安全造成極大的威脅。因此，冬蟲夏草真?zhèn)舞b定對于肅清和純凈市場，維護消費者權(quán)益具有非常重要的意義。

近些年，隨著中藥鑒定學(xué)研究和中藥標(biāo)準(zhǔn)化進程的不斷發(fā)展，中藥鑒定新技術(shù)、新方法不斷應(yīng)用，尤其分子生物學(xué)方法的引入，中藥品種混亂的現(xiàn)象得到了極大的改觀。冬蟲夏草真?zhèn)舞b定可通過性狀鑒定法、顯微鑒定法、理化鑒定法等傳統(tǒng)鑒定方法以及近年來發(fā)展的分子技術(shù)來實現(xiàn)。由于蟲草性狀及其中活性成分含量受到其生長條件、采收時間、貯藏等因素的影響而發(fā)生變化，采用傳統(tǒng)方法容易受到干擾而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。且傳統(tǒng)的這幾種方法對親緣關(guān)系較近的物種難以區(qū)分，且需要長期經(jīng)驗積累，鑒定結(jié)果受主觀判斷力影響極大，或受專業(yè)領(lǐng)域的局限。以核酸和蛋白為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)具有專一性強、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點，且不受個體形態(tài)、大小和完整性的影響，目前已廣泛用于檢測及鑒定工作中。但目前冬蟲夏草真?zhèn)舞b定分子檢測技術(shù)的報道很少，現(xiàn)有的相關(guān)研究主要集中于其無性型的分離和鑒定(楊靜，2005；Liang et al.，2008; Zhong et al.，2010；Leiet al.，2013)。2015年陳士林報道了采用DNA條形碼技術(shù)對冬蟲夏草真實性進行鑒定的方法，采用真菌通用ITS5F/4R引物得到ITS2序列，通過與數(shù)據(jù)庫中冬蟲夏草ITS2序列比對來鑒定受檢樣品的真實屬性。冬蟲夏草是一種復(fù)型真菌，根據(jù)其所處的不同階段，分為有性型(子囊孢子階段)和無性型(分生孢子階段)。通常所指的冬蟲夏草是它的有性型，換句話說，體現(xiàn)其商品性的是整個菌與蟲復(fù)合體。同一種真菌寄生于不同寄主上，或不同種真菌寄生于同一寄主上，產(chǎn)生的外形相似的復(fù)合體就可能作為偽品與正品混淆，而這樣的情況極大可能出現(xiàn)在冬蟲夏草與其偽品之間。因此，僅針對其真菌（包括其無性型）進行鑒定來判斷冬蟲夏草真?zhèn)问遣粔虻模瑧?yīng)該同時結(jié)合對其寄主的鑒定。

因此同時針對冬蟲夏草中蟲草菌及其寄主蝙蝠蛾特異核酸片段，建立一種準(zhǔn)確性高，簡單適用，易于推廣的冬蟲夏草高特異性PCR檢測方法，可以有效區(qū)別冬蟲夏草與偽品，或探及含有冬蟲夏草成分的產(chǎn)品，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容