[發(fā)明專利]一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710284515.2
• 申請(qǐng)日: 2017-04-25
• 公開（公告）號(hào): CN107090502B
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張富麗;牛蓓;宋君;雷紹榮;郭靈安;常麗娟;尹全;王東;劉文娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895
• 代理公司: 成都眾恒智合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51239
• 代理人: 王育信

1.一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)冬蟲夏草中蟲草菌的ITS和所述蟲草菌寄主的COI基因核酸片段，用于鑒定所述COI基因核酸片段的擴(kuò)增引物組為：

COI-F：GGAAATCCHGGATCTTTAATT

COI-R：GATGCCCCMGARTGTGCAAT；

用于鑒定所述ITS的擴(kuò)增引物組為：

CITS-F10’：GTTGCCTCGGCGGGAC

CITS-R10’-2：CMTTTGCTTGCTTCTTGACTGAG；

所述檢測(cè)方法包括以下步驟：

步驟1：合成引物組：合成所述用于鑒定ITS的擴(kuò)增引物組和用于鑒定COI基因核酸片段的擴(kuò)增引物組；

步驟2：制備待檢測(cè)樣品DNA稀釋液、陽性對(duì)照品DNA稀釋液、以及空白對(duì)照液；

步驟3：配制PCR反應(yīng)體系；

步驟4：PCR及電泳檢測(cè)；

其中，所述步驟4中的電泳檢測(cè)為將PCR反應(yīng)后所得的擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5 %瓊脂糖凝膠70V電泳40 min后凝膠成像儀照相分析，若陽性對(duì)照和待檢測(cè)樣品均擴(kuò)增出113 bp和302 bp兩條目標(biāo)條帶，而空白對(duì)照未出現(xiàn)條帶，則可判定待檢測(cè)樣品中含有冬蟲夏草成分；若陽性對(duì)照擴(kuò)增出113 bp和302 bp兩條目標(biāo)條帶，空白對(duì)照未出現(xiàn)條帶，待檢測(cè)樣品未擴(kuò)增出條帶，則可判定待檢測(cè)樣品中不含有冬蟲夏草成分。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟1合成的引物濃度均為10 μmol/l。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟2中待檢測(cè)樣品DNA稀釋液和陽性對(duì)照品DNA稀釋液的濃度均為50 ng/μl。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟3中配制PCR反應(yīng)體系，即將步驟2所得的DNA稀釋液加入到25 μl PCR反應(yīng)體系中，所述PCR反應(yīng)體系包括以下組分：

2×Taq PCR Master mix 12.0 μl

引物COI-F 1.0 μl

引物COI-R 1.0 μl

引物CITS-F10’ 1.0 μl

引物CITS-R10’-2 1.0 μl

DNA稀釋液 1.0 μl

水 8.0 μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟4中PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5~10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；然后延展72℃延伸5~7 min。