[發(fā)明專利]基因工程化類球紅細菌及其制備方法和法尼醇的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710282932.3
• 申請日: 2017-04-26
• 公開（公告）號: CN107119001B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發(fā)明（設計）人: 祁峰;黃建忠;陳學端;江賢章;張明亮
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P7/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京悅成知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11527
• 代理人: 樊耀峰;高艷麗

本發(fā)明公開了基因工程化類球紅細菌及其制備方法和法尼醇的生產(chǎn)方法。本發(fā)明通過將來自于鼠疫耶爾辛桿菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因轉化到類球紅細菌能夠在胞內表達，并產(chǎn)生具有活性的磷酸酶PgpB，從而可以直接催化類球紅細菌MEP途徑積累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地涉及一種類球紅細菌以及利用類球紅細菌生產(chǎn)法尼醇的方法。

背景技術

法尼醇(Farnesol)是一種無環(huán)倍半萜醇，化學式C₁₅H₂₆O，痕量存在于巴西檀木、黃葵子、金合歡、香茅、檸檬草、麝香、茉莉及橙花的香精油中。長期以來法尼醇作為一種香精成分廣泛應用于化妝品行業(yè)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)法尼醇還具有抑菌、抗炎和抗腫瘤等多種生物活性。除此之外法尼醇作為藥物成分可以顯著增加多種病原微生物(如金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、變形鏈球菌、禾谷鐮刀菌等)對藥物的易感性。

目前在國內外法尼醇的生產(chǎn)和提取方法還是從植物中提取為主。例如，中國專利申請CN102675398A公開了一種從羅漢果中提取羅漢果昔V和法尼醇的方法。干羅漢果經(jīng)破殼、減壓濃縮、陶瓷膜過濾、大孔樹脂吸附、梯度乙醇洗脫等步驟，將不同洗脫液進行脫色，采用結晶重結晶的方法分別得到羅漢果昔V和法尼醇純品。由于在植物中的含量極少，導致法尼醇的提取和純化都非常困難，因此此類方法的生產(chǎn)成本居高不下。

利用微生物合成并生產(chǎn)法尼醇是近幾年發(fā)展起來的技術，微生物生產(chǎn)方法具有培養(yǎng)過程簡單、生產(chǎn)周期短、提取和純化步驟少等優(yōu)勢，是目前工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)法尼醇等萜烯類化合物的理想途徑。

中國專利申請CN103571763A公開了一株從白酒酒醅中篩到的釀酒酵母，這種釀酒酵母能夠自身從頭合成多種萜烯醇，該酵母除了能夠生產(chǎn)法尼醇之外還可以合成里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-沒紅藥醇等萜烯類化合物，但是包括法尼醇在內的多種萜烯類化合物的產(chǎn)量均較低。

美國專利US 6689593公開了一種利用酵母或者大腸桿菌生產(chǎn)法尼醇的方法。該方法利用基因工程手段對酵母或大腸桿菌進行改造，降低了微生物胞內鯊烯合成酶的活性，同時過表達HMG-CoA還原酶基因和焦磷酸法尼脂合成酶基因，從而強化了HMG-CoA還原酶和焦磷酸法尼脂合成酶的活性。利用這種改造方法可以積累足夠多的焦磷酸法尼脂，能夠實現(xiàn)法尼醇和香葉醇在微生物胞內的合成。

綜上所述，目前國內外利用微生物生產(chǎn)法尼醇的報道很少。本領域內仍然需要微生物合成法尼醇的新方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將來自于鼠疫耶爾辛桿菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因轉化到類球紅細菌能夠在胞內表達，并產(chǎn)生具有活性的磷酸酶PgpB，從而可以直接催化類球紅細菌MEP途徑積累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。至少基于上述部分發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內容。

本發(fā)明的一方面，提供基因工程化類球紅細菌，其包含來自鼠疫耶爾辛桿菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因，且所述磷酸酶PgpB基因能夠在所述類球紅細菌的胞內表達，形成具有活性的磷酸酶PgpB。

在示例性實施方案中，所述類球紅細菌的胞內包含焦磷酸法尼酯。優(yōu)選地，所述焦磷酸法尼酯通過在胞內利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛為起始物質合成二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP，異戊二烯焦磷酸異構體)，進而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成。

在示例性實施方案中，所述類球紅細菌為Rhodobacter sphaeroides 2.4.1，其菌種編號ATCC17023。

在示例性實施方案中，所述磷酸酶PgpB基因的堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明的另一方面，提供基因工程化類球紅細菌的制備方法，其包括：