[發明專利]基因工程化類球紅細菌及其制備方法和法尼醇的生產方法

有效

• 申請號: 201710282932.3
• 申請日: 2017-04-26
• 公開（公告）號: CN107119001B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 祁峰;黃建忠;陳學端;江賢章;張明亮
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P7/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京悅成知識產權代理事務所(普通合伙) 11527
• 代理人: 樊耀峰;高艷麗

1.一種基因工程化類球紅細菌，其包含來自鼠疫耶爾辛桿菌CO92的磷酸酶PgpB基因，且所述磷酸酶PgpB基因能夠在所述類球紅細菌的胞內表達，形成具有活性的磷酸酶PgpB；

其中，在所述類球紅細菌的胞內包含焦磷酸法尼酯或可轉化為所述焦磷酸法尼酯的物質；

其中，所述焦磷酸法尼酯通過在胞內利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛為起始物質合成二甲基丙烯焦磷酸酯，進而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成。

2.根據權利要求1所述的基因工程化類球紅細菌，其中，所述類球紅細菌的菌種編號為ATCC17023。

3.根據權利要求1所述的基因工程化類球紅細菌，其中，所述磷酸酶PgpB基因的堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一種基因工程化類球紅細菌的制備方法，其包括：

構建重組質粒并轉化的步驟；和

通過細菌接合轉化所述重組質粒至類球紅細菌的步驟；

其中，所述構建重組質粒并轉化的步驟包括：

使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物從鼠疫耶爾辛桿菌CO92的基因組中克隆磷酸酶PgpB1基因；

以pBBR1MCS2載體為模板，使用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物克隆得到所述pBBR1MCS2載體的拼接片段，回收所述拼接片段；

將所述PgpB基因和所述拼接片段混合，40-60℃反應10-60分鐘，反應完畢之后轉化大腸桿菌T1細胞，挑取陽性克隆，提取質粒pBBR1MCS2-PgpB，將提取的質粒pBBR1MCS2-PgpB轉化大腸桿菌S17-1，挑取能夠在含Kan抗性的培養基上生長的陽性菌株，提取質粒驗證，獲得含有pBBR1MCS2-PgpB正確序列的大腸桿菌S17-1克隆作為供體菌。

5.根據權利要求4所述的基因工程化類球紅細菌的制備方法，其中，所述通過細菌接合轉化所述重組質粒至類球紅細菌的步驟包括：

在含有Kan抗生素的液體培養基中培養所述供體菌，在所述供體菌的OD₆₀₀達到0.4-0.6之間時停止培養并收集菌體；

在液體培養基中培養所述類球紅細菌，在其OD₆₀₀達到0.3-0.6之間時停止培養并收集菌體作為受體菌；

將收集的所述供體菌和所述受體菌分別稀釋重懸，并將所述供體菌和所述受體菌混合后涂布到固體無抗性平板培養基上培養，取平板上生長的菌落洗滌、重懸；

將重懸后的菌落涂布在含亞碲酸鉀和Kan的平板上培養后，挑取黑色接合子，即為所述基因工程化的類球紅細菌。

6.一種法尼醇的生產方法，其包括使用根據權利要求1-3任一項所述的基因工程化類球紅細菌的步驟。

7.根據權利要求6所述的法尼醇的生產方法，其進一步包括所述基因工程化類球紅細菌的發酵培養步驟，和/或法尼醇的檢測步驟。