[發明專利]可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞及其應用

有效

• 申請號: 201710282824.6
• 申請日: 2017-04-26
• 公開（公告）號: CN107142247B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 吳旭東;李睿
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙) 11413
• 代理人: 劉繼富;王春偉

本發明提供了一種可誘導的CRISPRon和CRISPRi小鼠胚胎干細胞及其制備方法，其中小鼠胚胎干細胞是A2Lox.Cre細胞，其可逆地表達dCas9?VPR融合蛋白或dCas9?KRAB融合蛋白。本發明還提供了一種調控基因表達的方法和試劑盒。本發明提供的可誘導的CRISPRon和CRISPRi小鼠胚胎干細胞，構建方法簡便，得到穩定陽性率高達90％以上；不編輯基因組序列，直接激活或者抑制基因表達；融合蛋白的表達具有可誘導性和可逆性；對基因的靶向調控具有可控性和多樣性。

技術領域

本發明涉及基因表達調控領域，特別涉及一種可誘導的CRISPRon和CRISPRi小鼠胚胎干細胞及其應用。

背景技術

RNA干擾(RNAi)或者基因過表達(overexpression，OE)是基因功能研究的常用方法。然而，RNAi是一種轉錄后調控，并且容易出現脫靶的現象；過表達(OE)往往利用克隆載體啟動子促進外源基因的表達，在不同細胞類型中啟動子的活性不穩定、不可控。

規律成簇的間隔短回文重復CRISPR與內切酶Cas9的組合，可以在引導RNA(sgRNA)的指引下，靶標并切割入侵者的DNA遺傳物質。2012年研究者們利用這一特點，將CRISPR系統制成了強大的基因組編輯工具(Jinek,M.等人，2012；Cong,L.等人，2013)。但是傳統的CRISPR/Cas9方法對基因的編輯可能造成在細胞基因組中預期之外的插入或刪除等。進一步的研究發現，Cas9兩個氨基酸點突變會導致酶活性喪失，稱之為dCas9。如果dCas9連接轉錄輔因子，在引導RNA(sgRNA)的指引下，無需切割DNA就可以有效地進行DNA序列特異性的調控。比如，如果dCas9串聯轉錄抑制輔因子如KRAB，則可以實現轉錄抑制(CRISPRi)；如果dCas9串聯轉錄激活輔因子如VP64，則可以實現轉錄激活(CRISPRon或者CRISPRactivation)(Dominguez,A.A.等人，2016)。利用這一方法，可以動態操縱絕大多數基因的轉錄。但該方法借助于轉座酶系統的隨機插入，可能會引起意外的基因組變化。

發明內容

為解決上述問題，本發明實施例公開了一種可誘導的CRISPRon和CRISPRi小鼠胚胎干細胞。技術方案如下：

一種可誘導的CRISPRon和CRISPRi小鼠胚胎干細胞，其中小鼠胚胎干細胞是A2Lox.Cre細胞，其可逆地表達dCas9-VPR融合蛋白或dCas9-KRAB融合蛋白。

在本發明的上下文中術語“A2Lox.Cre細胞”是指，在小鼠胚胎干細胞系E14的Rosa26位點整合表達rtTA，所獲得的陽性克隆按編號命名為A17。在A17的小鼠胚胎干細胞中的組成性表達的次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Hprt)基因的5'端整合插入TRE-LoxP-Cre-loxP-Δneo序列，所得的陽性克隆命名A2Lox.Cre(Iacovino,M.等人，2011)。TRE即四環素應答元件，rtTA與之結合后抑制下游基因轉錄，加入強力霉素(Doxycline，簡稱Dox)或者四環素的情況下則使rtTA改變構象而激活下游基因轉錄。Cre重組酶是細菌噬菌體P1的I型拓撲異構酶，被誘導表達以后可以催化LoxP位點間的DNA進行位點特異性重組。Δneo是缺少啟動子和起始密碼子的新霉素neomycin編碼基因(neo)，因此neo無法表達，此時該細胞不具備G418抗性。

在本發明的上下文中術語“dCas9-VPR”是指，三個已知的轉錄激活蛋白VP64-p65-Rta(VPR)串聯后與無活性的dCas9的融合蛋白。通常斜體“dCas9-VPR”表示編碼這三個轉錄激活蛋白的與無活性dCas9的融合蛋白的核酸。

在本發明的上下文中術語“dCas9-KRAB”是指，已知的轉錄抑制蛋白KRAB與無活性的dCas9的融合蛋白。通常斜體“dCas9-KRAB”表示編碼轉錄抑制蛋白KRAB的與無活性dCas9的融合蛋白的核酸。