[發明專利]可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞及其應用

有效

• 申請號: 201710282824.6
• 申請日: 2017-04-26
• 公開（公告）號: CN107142247B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 吳旭東;李睿
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙) 11413
• 代理人: 劉繼富;王春偉

1.一種可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞的制備方法，其包括以下步驟：

(1)PCR擴增dCas9-VPR基因或dCas9-KRAB基因，并構建到含有LoxP位點的載體上，分別得到構建體質粒；

(2)在A2Lox.Cre細胞中加入強力霉素，誘導后，分別轉染步驟(1)中得到的構建體質粒，再加強力霉素誘導；誘導完成后，加入G418進行篩選；

(3)將步驟(2)篩選得到的細胞擴增后加入強力霉素誘導，誘導后，篩選出可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞。

2.根據權利要求1所述的可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞的制備方法，其中步驟(1)中，PCR擴增dCas9-VPR基因或dCas9-KRAB基因，并分別構建到pCR-Entry載體上，然后通過LR反應同源重組到含有LoxP位點的p2Lox-FLAG載體上，分別得到構建體質粒p2Lox-FLAG-dCas9-VPR或p2Lox-FLAG-dCas9-KRAB。

3.一種調控基因表達的方法，其包括(1)設計靶向目的基因的sgRNA序列；(2)將sgRNA克隆到pLX-sgRNA載體；(3)包裝慢病毒；(4)用攜帶有sgRNA的慢病毒感染權利要求1或2的方法制備的可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞。

4.根據權利要求3所述的方法，其中sgRNA靶向目的基因的調控序列，所述目的基因的調控序列為啟動子或增強子。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其中通過改變強力霉素的濃度來調控基因表達水平，強力霉素的濃度為20-1000ng/ml。

6.一種功能基因的篩選方法，其包括設計并合成sgRNA文庫，利用所述sgRNA文庫在權利要求1或2所述的方法制備的可誘導的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干細胞或者其特定的分化細胞類型中進行基因篩選，確定各sgRNA所對應基因的功能。