[發明專利]一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201710277895.7
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN107312831A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 張銳;蘭文升;孫美榕;王康
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學;深圳市檢驗檢疫科學研究院;深圳市中大創新生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 張月光,林偉斌

技術領域

本發明屬于海洋微生物檢測技術領域，具體地，涉及一種同時檢測四種海洋弧菌的試 劑盒及其檢測方法。

背景技術

近年來，由于海洋漁業資源的日漸衰退，漁業捕撈量已大幅度下降，單靠海洋捕撈已 遠遠不能滿足我國人民對海洋水產品的需求，因此，海水養殖得到普遍重視和大力發展。擴 大魚類增養殖，開發魚類蛋白資源是當今世界水產增養殖中最活躍的科研開發工作，水產養 殖已成為世界上增加魚類來源最迅速的方式，也是水產品生產發展的必然趨勢。

弧菌病(Vibriosis)是由弧菌屬細菌(Vibrio spp.)引起的一類細菌性疾病，該病在全球范 圍內廣泛發生，其暴發性流行不僅給海水養殖魚類、貝類及甲殼類等經濟動物的養殖業造成 巨大的經濟損失，還導致野生的海水魚類、貝類及甲殼類大量死亡，因此，對該類疾病的研 究一直備受國內外研究工作者的關注，是海水養殖動物病害的主要研究領域之一。國外對海 水魚類弧菌病的研究始于20世紀初，自20世紀60年代后相繼對多種弧菌屬的致病菌有較豐 富的研究和報道。在我國，海水養殖業經歷了藻、蝦、貝的3次養殖浪潮之后，又相繼迎來 了90年代形成的海水魚類養殖的第4次養殖高潮。然而，由于養殖面積過速擴展、養殖密度 過高和管理不當，養殖魚類疾病繁生，造成巨大的經濟損失。由弧菌引起的死亡時有報道， 弧菌病被公認為是魚類養殖中最為嚴重的病害之一，是該行業發展的重要限制性因素。

做好海水中弧菌的檢測是預防海洋水產疾病的重要前提，而陽性對照在海水弧菌檢測 工作中必不可少，但是由于作為陽性對照的樣本不易獲得和不穩定性，樣本直接作為陽性對 照可操作性差，不利于快速高效的對弧菌進行檢測。另外，如何進一步提高普通熒光定量PCR 的靈敏度也是當前迫切需要解決的問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中海洋弧菌檢測缺少陽性對照物以及熒 光定量PCR靈敏度不高的缺陷和不足，提供一種含有陽性對照物的熒光定量PCR試劑盒； 所述試劑盒的靈敏度提高了100倍，基本對模板中100copies/μL的目標序列可以有效檢出， 在海洋弧菌檢測中具有較大的應用前景。

本發明的目的是提供一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒。

本發明的另一目的是提供利用上述試劑盒檢測海洋弧菌的方法。

本發明的再一目的是提供上述試劑盒及方法的應用。

本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒，包括熒光定量PCR所需試劑，還包括陽性對照物，4 對熒光PCR引物和4條分子信號探針和PCR引物；所述陽性對照物為含有霍亂弧菌、副溶 血弧菌、溶藻弧菌和創傷弧菌16SrDNA序列的質粒；所述4對熒光PCR引物和分子信號探 針依次如SEQ ID NO.3～14所示；所述PCR引物如SEQ ID NO.1～2所示。

本發明通過擴增霍亂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和創傷弧菌的16SrDNA靶基因， 連接到T-vector載體，一方面作為試劑盒的陽性對照物，另一方面由于重組質粒濃度穩定和 非常易于不斷擴增，在試劑盒的研發過程中當作標準樣本，測試檢測試劑盒的特異性和敏感 性，通過將熒光定量PCR的模板預先進行普通PCR，可大大提高熒光定量PCR的靈敏度。

優選地，所述質粒為陽性質粒pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va。

一種同時檢測四種海洋弧菌的方法，先提取待測弧菌樣品DNA，再將待測樣品和權利 要求1中的陽性對照物用權利要求1中所述PCR引物SEQ ID NO.1～2進行預擴增，再將預 擴增的PCR產物用引物SEQ ID NO.3～14進行熒光定量PCR檢測，通過陽性對照物比較， 計算出待測樣品中四種弧菌的含量。

優選地，所述預擴增的PCR反應體系：2x Ex Taq Mixture 12.5μL，上游引物1μL， 下游引物1μL，模板3μL，ddH2O 7.5μL，共25μL；所述PCR反應程序為：95℃，4 min；94℃45s，42℃45s，72℃45s，2個循環；94℃45s，43℃45s，72℃45s，2個循環； 94℃45s，44℃45s，72℃45s，2個循環；94℃45s，45℃45s，72℃45s，2個循環；94℃ 45s，46℃45s，72℃45s，2個循環；94℃45s，47℃45s，72℃45s，2個循環；94℃45s， 48℃45s，72℃45s，2個循環；94℃45s，49℃45s，72℃45s，2個循環；94℃45s，45℃ 45s，72℃45s，15個循環；72℃，5min；4℃，Pause。