[發明專利]一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201710277895.7
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN107312831A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 張銳;蘭文升;孫美榕;王康
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學;深圳市檢驗檢疫科學研究院;深圳市中大創新生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 張月光,林偉斌

1.一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒，包括熒光定量PCR所需試劑，其特征在于，還包括陽性對照物，4對熒光PCR引物和4條分子信號探針和PCR引物；所述陽性對照物為含有霍亂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和創傷弧菌16SrDNA序列的質粒；所述4對熒光PCR引物和分子信號探針依次如SEQ ID NO.3～14所示；所述PCR引物如SEQ ID NO.1～2所示。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述質粒為陽性質粒pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va。

3.權利要求1或2所述試劑盒在海洋弧菌檢測中的應用。

4.一種同時檢測四種海洋弧菌的方法，其特征在于，先提取待測弧菌樣品DNA，再將待測樣品和權利要求1中的陽性對照物用權利要求1中所述PCR引物SEQ ID NO.1～2進行預擴增，再將預擴增的PCR產物用引物SEQ ID NO.3～14進行熒光定量PCR檢測，通過陽性對照物比較，計算出待測樣品中四種弧菌的含量。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述預擴增的PCR反應體系：2x Ex Taq Mixture 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板3 μL，ddH2O 7.5 μL，共25 μL；所述PCR反應程序為：95℃，4 min；94℃ 45s，42℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，43℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，44℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，46℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，47℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，49℃ 45s，72℃ 45s，2個循環；94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 45s，15個循環；72℃，5min；4℃，Pause。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的反應體系為：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，探針0.08 μL，Mix 10 μL，Rox 0.5 μL，預擴增產物2 μL，雙蒸水補足至20 μL；所述熒光定量PCR反應程序為：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 10 min，60℃ 1 min，40個循環。

7.權利要求4～6任一所述方法在海洋弧菌檢測中的應用。