[發明專利]一種反光素蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201710277250.3
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN107475332B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 謝燦;管哲;蔡甜甜
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標代理有限公司 11012
• 代理人: 黃澤雄;陳悅軍

本發明屬于生物技術領域，提供了一種反光素蛋白的提取方法，包括步驟：培養表達反光素蛋白的菌株，收獲菌體并超聲裂解；離心獲得沉淀后在多種緩沖液中重懸、溫育并純化。利用本發明的方法能夠獲得具有活性的可溶形式的反光素蛋白，為研究反光素蛋白的性質以及更好地使用反光素蛋白提供了有利條件。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及反光素蛋白的提取。

背景技術

頭足類動物(包括章魚、墨魚和魷魚)能夠快速地調節自身皮膚的顏色，從而與環境融為一體進行隱蔽，或者與環境形成鮮明的對比，達到警戒獵食者保護自身不受攻擊的效果。頭足類動物這種動態的顏色變化主要原因之一是由細胞組織中有序排列的微觀結構對光線的物理作用而產生的結構性色彩。負責這種動態的結構性色彩的微觀結構是由一種特殊的蛋白質——反光素蛋白(reflectin)組成的。反光素蛋白在頭足動物的細胞組織中廣泛分布，并且具有多種形態和組裝類型，它們的光學性質已經被廣泛研究，然而關于這個蛋白的結構以及由反光素蛋白引起的結構色的內在復雜分子機制所知甚少。如果能夠得到反光素蛋白的結構以及分子組裝形式，對于理解頭足動物動態結構色的變化具有重要的意義，而最關鍵的一步是得到具有活性的可溶形式的反光素蛋白。

目前獲得反光素蛋白的方法主要是利用包涵體變性的方法純化重組表達的反光素蛋白，包括：培養表達反光素蛋白的菌株、收獲菌體并超聲裂解，利用尿素和鹽酸胍將包涵體徹底變性，然后通過鎳柱親和層析以及反相色譜柱進行純化。蛋白所在的溶液環境始終含有變性劑鹽酸胍或者其它有機溶劑(如乙腈)，所以得到的反光素蛋白是只有一級結構的線性分子，不具有生物活性。同樣地，由于反光素蛋白在生理條件以及一般實驗所用到的各種緩沖液中都具有極低的溶解性，其它的提取蛋白質的方法也都無法得到具有活性的可溶形式的反光素蛋白。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術的上述問題，提供一種能夠獲得具有活性的可溶形式的反光素蛋白的方法。

本發明的反光素蛋白的提取方法包括以下步驟：

1)培養表達反光素蛋白的菌株，收獲菌體并超聲裂解；

優選地，所述表達反光素蛋白的菌株為大腸桿菌BL21(DE3)菌株，其包含表達載體pCOLD1，所述表達載體包含編碼反光素蛋白的基因；進一步優選地，所述編碼反光素蛋白的基因為SoRef2基因，所述基因的序列如GenBank ID：HE687200.1所示；

優選地，當所述菌株在OD600達到0.6-0.8時，在288K的溫度下利用終濃度為20μM的IPTG誘導20小時；

優選地，在誘導表達并收獲菌體后，將菌體重懸于緩沖液T中，置于冰上超聲裂解，所述緩沖液T包含20mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0；優選地，超聲裂解的參數為：200-220w，工作時間10s、間隙時間5s，循環100次；

2)離心步驟1)得到的裂解液，收集沉淀，將沉淀重懸于緩沖液R中，溫育30min～1h，再次離心并收集沉淀，所述緩沖液R包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.3％～1％(體積比)Triton X-100，pH 8.0；優選地，所述緩沖液R包含20mM Tris、150mM NaCl、0.5％TritonX-100，pH 8.0；優選地，所述溫育在旋轉搖床中室溫下進行；優選地，所述離心為15000rpm，30min；

3)將步驟2)得到的沉淀清洗三次，優選地，使用超純水清洗；然后重懸于緩沖液S中，溫育30min以上，離心，所述緩沖液S包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.05％～2％SDS，pH 8.0；優選地，所述緩沖液S包含20mM Tris、150mM NaCl、0.05％SDS，pH 8.0；優選地，所述溫育在旋轉搖床中室溫下進行；優選地，所述離心為15000rpm，30min；