[發(fā)明專利]一種反光素蛋白的提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710277250.3
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN107475332B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝燦;管哲;蔡甜甜
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標(biāo)代理有限公司 11012
• 代理人: 黃澤雄;陳悅軍

1.一種反光素蛋白的提取方法，包括：

1)培養(yǎng)表達(dá)反光素蛋白的菌株，收獲菌體并超聲裂解；

2)離心步驟1)得到的裂解液，收集沉淀，將沉淀重懸于緩沖液R中，溫育30min～1h，再次離心并收集沉淀，所述緩沖液R包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.3％～1％Triton X-100，pH 8.0；

3)將步驟2)得到的沉淀清洗三次，然后重懸于緩沖液S中，溫育30min以上，離心，所述緩沖液S包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.05％～2％SDS，pH 8.0；

4)取步驟3)的離心上清液，向其中加入咪唑，利用Ni-NTA親和層析純化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括：

5)將步驟4)獲得的蛋白溶液利用凝膠過濾層析進(jìn)一步分離；所述凝膠過濾層析使用柱Superdex 200 10/300GL(GE Healthcare,Sweden)，流動相緩沖液包含10～20mM Tris、0.05％～2％SDS，pH 8.0。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述流動相緩沖液包含20mM Tris、0.1％SDS，pH8.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2)中，所述緩沖液R包含20mM Tris、150mMNaCl、0.5％Triton X-100，pH 8.0；步驟3)中，所述緩沖液S包含20mM Tris、150mM NaCl、0.05％SDS，pH 8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟4)中，所述親和層析使用緩沖液W清洗柱子25～40個柱體積，使用洗脫緩沖液E洗脫蛋白，所述緩沖液W包含10～20mM Tris、150mM NaCl、10mM～40mM咪唑、0.05％～2％SDS，pH 8.0，所述緩沖液E包含10～20mM Tris、150mM NaCl、200mM以上的咪唑和0.05％～2％SDS，pH 8.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述緩沖液W包含20mM Tris、150mM NaCl、20mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0；所述緩沖液E包含20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述親和層析使用緩沖液W清洗柱子30個柱體積。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟4)中，所述咪唑的終濃度為10mM。

9.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項所述的方法，其中，步驟2)和3)中，所述溫育在旋轉(zhuǎn)搖床中室溫下進(jìn)行，所述離心為15000rpm，30min。

10.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項所述的方法，其中，步驟1)中，所述表達(dá)反光素蛋白的菌株為大腸桿菌BL21(DE3)菌株，其包含表達(dá)載體pCOLD1，所述表達(dá)載體包含編碼反光素蛋白的基因。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述編碼反光素蛋白的基因為SoRef2基因，所述基因的序列如GenBank ID：HE687200.1所示。

12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，當(dāng)所述菌株在OD600達(dá)到0.6-0.8時，在288K的溫度下利用終濃度為20μM的IPTG誘導(dǎo)20小時。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，在誘導(dǎo)表達(dá)并收獲菌體后，將菌體重懸于緩沖液T中，置于冰上超聲裂解，所述緩沖液T包含20mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述超聲裂解的參數(shù)為：200-220w，工作時間10s、間隙時間5s，循環(huán)100次。